微生物數(shù)量巨大、種類繁多，被稱為人體第二套基因組，既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)微生物與多種疾病相關(guān)。不同的微生物具有其特異性，隨著微生物的特性及其與人類健康的關(guān)系被逐步探索明確，微生物的臨床應(yīng)用也被陸續(xù)開發(fā)。第一代微生物應(yīng)用是益生菌作為膳食補(bǔ)充劑的開發(fā)，這一類產(chǎn)品并沒有預(yù)防或者治療疾病的能力。第二代微生物應(yīng)用把某些具有潛在療效的微生物開發(fā)為藥物。早在1958年，國外就有通過糞菌移植（FMT）治愈腸炎的案例，而FMT近年來也被研究用于治療其他疾病，如肝性腦病、難治性移植物抗宿主病、慢性功能性便秘、腸易激綜合征等。此外，某些微生物本身的溶瘤以及免疫激活作用，也可以開發(fā)用作腫瘤生長抑制劑或免疫刺激劑。然而，F(xiàn)MT治療不具有靶向性，其對于疾病治療的作用機(jī)制不明確，且糞便中的病毒和雜質(zhì)較多，使得FMT治療效果良莠不齊；另一方面，微生物自身特異性也往往伴隨著一定的局限性，比如專性厭氧菌（如雙歧桿菌）雖然能成功靶向腫瘤，卻不具備直接溶瘤能力；兼性厭氧致病菌（如鼠傷寒沙門氏菌、梭狀芽孢桿菌）則天然毒性過強(qiáng)。這些微生物的天然特性限制了它們作為生物活體藥的開發(fā)和推廣。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，研究人員想到用合成生物學(xué)的手段來對微生物進(jìn)行改造，以進(jìn)一步平衡活菌療法的有效性和安全性。作為一門以理性設(shè)計(jì)生物行為為目標(biāo)的學(xué)科，合成生物學(xué)利用細(xì)菌作為模塊化的工程平臺，將基因和啟動子元件合理設(shè)計(jì)組合，創(chuàng)造出微妙而復(fù)雜的基因線路，從而能夠更精確地控制細(xì)菌的生理行為，加強(qiáng)對細(xì)菌的生物安全控制，調(diào)控細(xì)菌表達(dá)治療分子的釋放，增強(qiáng)細(xì)菌對疾病的治療能力[1]。這種通過設(shè)計(jì)編輯工具以及反饋回路構(gòu)建的具有診斷疾病或者靶向治療疾病的工程菌株也被稱為“改造菌”。改造菌在臨床上的應(yīng)用包括診斷和治療兩部分在診斷方面，微生物可以發(fā)揮它快速增殖的特點(diǎn)，將檢測到的信號無限放大，以提升疾病檢測的敏感度；在治療方面，有兩條實(shí)施路徑：1）體內(nèi)改造，通過基因編輯選擇性地靶向并沉默/殺死細(xì)菌（如Eligo公司）
2）體外改造，利用細(xì)菌作為載體把藥物運(yùn)輸?shù)教囟ㄎ恢靡赃_(dá)到治療目的（如Synlogic公司）
改造菌的應(yīng)用廣泛，本文將重點(diǎn)討論把微生物體外改造作為活體生物藥 (Live biotherapeutic products, LBPs) 的應(yīng)用。
（工程菌內(nèi)基因回路由感應(yīng)元件、基因元件以及報(bào)告元件三部分組成。在接受到體外信號后，通過體內(nèi)基因回路計(jì)算操控工程菌的行為，表達(dá)報(bào)告因子作為診斷，治療因子用以治療，毒性因子用以殺死病原菌）改造菌作為LBP應(yīng)用得到動物試驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證
香港大學(xué)黃建東教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)基因編程改造的沙門氏菌YB1不僅可以作為載體遞送藥物攻擊實(shí)體瘤，而且可以通過激活體內(nèi)NK細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌IFN-γ，在多個(gè)小鼠模型中抑制癌癥轉(zhuǎn)移[3]。韓國全南國立大學(xué)證實(shí)一種減毒的沙門氏菌菌株能夠在腫瘤中定植，并可以過量表達(dá)鞭毛蛋白B，誘導(dǎo)強(qiáng)大的免疫反應(yīng)[4]。美國加州大學(xué)研究人員通過刪除E.coli的精氨酸抑制基因 (ArgR)，整合不受負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制的ArgA fbr突變，改造出一種工程益生菌——L-Arg細(xì)菌，這種改造菌能夠特異性地定植于腫瘤，將腫瘤中積累的代謝廢物“氨”轉(zhuǎn)化為L-精氨酸，從而促進(jìn)T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答。另外，L-Arg細(xì)菌與PD-L1靶向抗體聯(lián)合治療提升了30%的治療效果，74%接受聯(lián)合療法的小鼠的腫瘤都完全消退了，而在它們再次接種MC38 細(xì)胞，腫瘤并沒有重新生長，這說明小鼠已經(jīng)形成長效免疫了[5]。經(jīng)過人工改造的工程菌作為一種有效的活體生物藥，能夠靶向遞送藥物分子，到達(dá)某些口服、腸外藥物難以到達(dá)的地方（如結(jié)腸、實(shí)體瘤內(nèi)部）并定植，不但避免了某些半衰期短的藥物在到達(dá)作用部位前就已經(jīng)被降解的問題，而且降低了全身暴露，提高了安全性。此外，改造菌不僅能實(shí)現(xiàn)藥物靶向精準(zhǔn)遞送，還能實(shí)現(xiàn)藥物的特異性表達(dá)、降低細(xì)胞天然毒力、增強(qiáng)侵蝕性和定植能力、避免細(xì)菌逃逸，同時(shí)提高了LBP治療的有效性和安全性。此外，也有專家認(rèn)為相較于以AAV（腺相關(guān)病毒）等為載體的基因治療產(chǎn)品，細(xì)菌載體基因治療產(chǎn)品在藥物價(jià)格等方面也有潛在優(yōu)勢。這些特殊優(yōu)勢使得改造菌在調(diào)節(jié)代謝平衡、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤抑制等方面都能發(fā)揮精準(zhǔn)治療的作用，為疾病的治療方案的開發(fā)提供了更大的發(fā)展空間。1）調(diào)節(jié)代謝平衡代謝物通過血流和腸腔之間的上皮屏障運(yùn)輸。改造菌可以感知腸道微環(huán)境中的環(huán)境信號，并釋放某些人體缺失的酶，幫助維持特定代謝物的健康水平。圖3.改造菌感知并調(diào)節(jié)代謝平衡[6]苯丙酮尿癥（phenylketonuria, PKU）是一種由于無法代謝苯丙氨酸（phenylalanine, Phe）而使其積累引起神經(jīng)毒性的基因缺陷疾病。表達(dá)Phe降解酶的基因能夠通過基因編輯手段被整合到益生菌中，調(diào)控兩種Phe降解酶的編導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)血液中Phe的代謝。此外，前面提到的經(jīng)過改造的L-Arg細(xì)菌也可以用于治療另一種代謝疾病——高氨血癥。2）免疫調(diào)節(jié)毒素、微生物等可以通過腸道中泄漏的上皮屏障進(jìn)入血流，這一通道導(dǎo)致免疫細(xì)胞的聚集，從而誘發(fā)炎癥。改造菌可以感知腸道微環(huán)境和炎癥特異性代謝產(chǎn)物以診斷炎癥反應(yīng)，也可以被設(shè)計(jì)產(chǎn)生抑制免疫系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子[6]。圖4.改造菌產(chǎn)生細(xì)胞因子抑制炎癥[6]Cyanovirin-N (CV-N) 是一種獨(dú)特的氨基酸蛋白，研究證實(shí) CV-N在低納摩爾濃度下可以干擾病毒（如HIV-1和 HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒和貓免疫缺陷病毒等）與靶細(xì)胞受體間相互作用，鏈球菌可以被改造成為一種遞送CV-N并局部靶向給藥的載體[7]。HIV-gp41-溶血素A是一種可以阻斷 HIV 與靶細(xì)胞融合并進(jìn)入靶細(xì)胞以發(fā)揮抗HIV作用的雜合肽，E.coli可以作為載體遞送HIV-gp41-溶血素A[8]。3）腫瘤抑制惡性實(shí)體腫瘤生長發(fā)育的營養(yǎng)來源依賴復(fù)雜的脈管網(wǎng)絡(luò)。在實(shí)體瘤內(nèi)復(fù)雜的脈管分布中，由于血管走行扭曲，血液流通不暢，形成了中心厭氧區(qū)，導(dǎo)致大部分藥物分子很難深入實(shí)體瘤內(nèi)部，因此藥物分子對實(shí)體瘤的治療效果大打折扣。這也是導(dǎo)致CAR-T療法在白血病等血液腫瘤中有不錯(cuò)的治療效果但在實(shí)體瘤中卻反饋不佳的原因。然而，氧氣濃度恰恰成為了大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、梭狀芽孢桿菌等兼性或?qū)Ｐ詤捬蹙兄桶邢蚰[瘤微環(huán)境的燈塔，它為這類細(xì)菌的靶向定植提供了指引，使其更好地定植于腫瘤。除了某些細(xì)菌本身具有溶瘤作用，利用部分厭氧菌趨向于低氧環(huán)境的特性，我們可以把微生物作為載體將藥物深度遞送進(jìn)腫瘤內(nèi)，重新激活或者促進(jìn)免疫應(yīng)答，如前文提及的改造E.coli的例子。目前已經(jīng)報(bào)道的細(xì)菌遞送藥物分子，包括Cly-A、DT-A、TRAIL等細(xì)胞毒性藥劑，或者IL-2、IL-18、CCL21等細(xì)胞因子，或者p53等調(diào)控因子，或者Stat3等小分子干擾RNA等[9]。此外，改造菌也可以通過誘導(dǎo)低水平的炎癥，來促進(jìn)免疫檢查點(diǎn)抑制劑更有效地發(fā)揮抗癌療效。改造菌作為LBP有其獨(dú)特的優(yōu)勢，同時(shí)也有一定的局限性，如改造菌遞送藥物無法到達(dá)通常無菌的區(qū)域（如大腦、骨骼等）。此外，改造菌在實(shí)際開發(fā)應(yīng)用過程中也面臨著重重挑戰(zhàn)。合成生物學(xué)是一門多學(xué)科高度融合、精妙且高效的工具，它對使用者的要求較高，基因編輯技術(shù)的成熟度很大程度影響了改造菌的有效性和穩(wěn)定性。目前常用的改造手段包括CRISPR/Cas 9和同源重組。被稱為“基因魔剪”的Crispr/Cas 9能夠?qū)π∑位蜻M(jìn)行剪切、沉默和失活等改造操作，可擴(kuò)展空間更廣；而同源重組作為一種成熟的基因改造技術(shù)，使用起來更加直接簡單，也有專家認(rèn)為它的改造效率更高。開發(fā)工程治療菌的限制不僅在于對合成生物學(xué)工具的應(yīng)用，更多在于對疾病病理的了解以及對LBP治療疾背后機(jī)理的深入探索，才能更好地平衡改造菌的有效性和安全性。在選擇適應(yīng)癥時(shí)，也應(yīng)該考慮是否有更簡單合適的治療方式，才能更好地滿足臨床的需求。不同的微生物具有不同的天然特征，包括區(qū)域偏好、定植時(shí)間、代謝途徑和調(diào)節(jié)途徑等，這也使它們成為特定應(yīng)用的最佳宿主，底盤菌種的選擇應(yīng)該取決于宿主體內(nèi)的靶點(diǎn)和預(yù)期宿主反應(yīng)。目前常被用于實(shí)驗(yàn)改造的模式菌（如乳酸乳球菌、大腸桿菌）多為非厭氧菌，而實(shí)際能夠經(jīng)過腸道發(fā)揮作用的多為厭氧菌，但厭氧菌的提取、培養(yǎng)、改造、運(yùn)輸是比較困難的，針對非模式菌的改造，還有很多未知內(nèi)容需要探索。最近，MIT科學(xué)家開發(fā)出一種用來保護(hù)厭氧菌的新型自組裝細(xì)胞涂層，這種細(xì)胞涂層能夠使厭氧菌在加工制造時(shí)不被破壞，這也將成為微生物療法開發(fā)的一劑催化劑[10]。實(shí)現(xiàn)有效性和安全性的平衡是改造菌開發(fā)的重要瓶頸。早在2019年，改造菌賽道領(lǐng)跑者Synlogic公司曾在Nature子刊上報(bào)導(dǎo)了用于治療高氨血癥的SYNB1020管線在52個(gè)健康人Ⅰ期臨床試驗(yàn)取得的良好結(jié)果，但是后續(xù)在23個(gè)病人的1b/2a期臨床研究卻發(fā)現(xiàn)“沒有證據(jù)表明SYNB1020 可以降低血氨”，這一菌株的開發(fā)也就停止了。在實(shí)際改造中，如何確保改造菌能夠到達(dá)特定位置實(shí)現(xiàn)靶向給藥、如何增強(qiáng)菌株的定植能力以減少重復(fù)給藥、如何利用微生物的特性和基因編輯手段實(shí)現(xiàn)藥物的特異性表達(dá)，這些都是影響改造菌有效應(yīng)用的問題。安全性方面，不僅要確保改造菌的功能穩(wěn)定性，避免突變和功能丟失，還要防止細(xì)菌逃逸，避免細(xì)菌傳播給密切接觸者或者環(huán)境。此外，改造菌和人體的復(fù)雜交互作用也是值得探索的。截至目前，美國FDA尚未批準(zhǔn)任何一種LBP上市。除了有效性、安全性需要經(jīng)過臨床驗(yàn)證，從臨床應(yīng)用的角度還需考慮具體的給藥方案，以達(dá)到最穩(wěn)定、安全的給藥效果，從LBP開發(fā)的監(jiān)管角度還需考慮穩(wěn)定性、批次間一致性。通過建立模型、菌株優(yōu)化及體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)篩選得到的候選菌株，需要考慮下游大規(guī)模生產(chǎn)的因素，如發(fā)酵過程中的細(xì)胞活性、pH、溫度及給藥途徑、劑量、以及針對不同患者的特定治療方案等等。圖6.設(shè)計(jì)活菌療法的考慮因素[11]目前全球范圍內(nèi)已有不少玩家進(jìn)入改造菌賽道，多數(shù)瞄準(zhǔn)在遺傳代謝病、炎癥性疾病、實(shí)體瘤等適應(yīng)癥。少數(shù)公司也布局了腦-腸軸相關(guān)的改造菌管線，但是從最近Cell期刊發(fā)表的對于腸道菌群與自閉癥的因果關(guān)系的顛覆性文章來看[12]，這個(gè)方向還是有一定的不確定性。在改造菌賽道出發(fā)得比較早的是美國的Synlogic公司，2017年已經(jīng)在納斯達(dá)克上市，現(xiàn)有管線產(chǎn)品主要針對代謝、免疫兩類適應(yīng)癥，治療PKU的兩款產(chǎn)品（SYNB1618、SYNB1934）已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅱ期，其中SYNB1618曾獲FDA授予的孤兒藥稱號，最近發(fā)布的II 期研究中期分析中SYNB1618也顯示出在多個(gè)劑量水平、多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上降低Phe的臨床意義。此外，Synlogic最近還宣布與 Ginkgo 合作研發(fā)用于治療高胱氨酸尿癥（HCU）藥物 SYNB1353。國內(nèi)包括和度生物、Delonix（羽冠生物）、港藥溶瘤在內(nèi)幾家企業(yè)也在該賽道中嶄露頭角。和度生物在2021年10月份完成了Pre-A輪融資，目前的管線瞄準(zhǔn)在腫瘤免疫、自身免疫和代謝疾?。籇elonix是2020年創(chuàng)立的企業(yè)，在2021年3月份完成了1400萬美元的種子輪融資，管線產(chǎn)品也獨(dú)樹一幟，開發(fā)合成疫苗和活菌藥物；港藥溶瘤是2021年成立的公司，重點(diǎn)關(guān)注溶瘤細(xì)菌的產(chǎn)品開發(fā)，核心產(chǎn)品YB1即將進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。合成生物學(xué)技術(shù)的逐漸成熟賦予了微生物療法新的能量，改造菌的靶向精準(zhǔn)給藥、特異性表達(dá)藥物等特殊優(yōu)勢也充分展現(xiàn)出了巨大的臨床應(yīng)用潛力。然而要塑造足夠聰明的改造菌也并非易事，到底哪一個(gè)改造菌“戰(zhàn)隊(duì)”能夠率先走上臨床應(yīng)用的戰(zhàn)場，讓我們拭目以待。[1] 劉陳立,等.集成技術(shù),2021,10(04):78-92.[2] 祝潔,等.生物工程學(xué)報(bào),2019,35(12):2350-2366.[3] Lin Q, et al. 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來源：藍(lán)色彩虹
藍(lán)色彩虹是由華大發(fā)起，服務(wù)于全球生命科學(xué)初創(chuàng)公司的孵化與創(chuàng)投平臺。關(guān)注生命科學(xué)領(lǐng)域在DNA、RNA、蛋白、細(xì)胞、組織等多組學(xué)尺度上的前沿研究與技術(shù)，致力營造全要素支持的創(chuàng)新生態(tài)，提升產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化效能。下設(shè)奇跡之光創(chuàng)業(yè)投資基金，專注于生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)鏈具有極高增長潛力的早期項(xiàng)目投資。2015年成立至今，幫助了數(shù)十家生命科學(xué)初創(chuàng)項(xiàng)目在創(chuàng)業(yè)早期快速成長，累計(jì)項(xiàng)目估值超百億，培養(yǎng)超過150個(gè)生命健康領(lǐng)域的高端復(fù)合創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才。
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