造血干細胞（hematopoietic stem cell, HSC）維持整個造血系統(tǒng)的細胞群體組成與功能。內(nèi)皮-造血轉化（endothelial-to-hematopoietic transition, EHT）是HSC重要的起源過程：在背主動脈的腹側，部分早期動脈內(nèi)皮細胞（early arterial endothelial cell, eAEC）特化為生血內(nèi)皮細胞（hemogenic endothelial cells, HEC），產(chǎn)生造血干細胞前體（pre-HSC），進而成熟發(fā)育為長期造血干細胞（long-term hematopoietic stem cell, LT-HSC）。雖然單細胞轉錄組分析及功能實驗驗證剖析了從eAEC向HSC發(fā)育的動態(tài)軌跡上的不同細胞群體^{1, 2}，但是，HSC譜系起源和命運決定是如何受到包括染色質三維結構、組蛋白修飾及轉錄因子的多維表觀機制整合調(diào)控的，則尚未可知。

2022年1月17日，北京大學未來技術學院分子醫(yī)學研究所、北大-清華生命科學聯(lián)合中心何愛彬研究組在Nature Communications雜志在線發(fā)表研究論文“Pre-configuring chromatin architecture with histone modifications guides hematopoietic stem cell formation in mouse embryos”，從跨尺度的染色質三維結構、組蛋白修飾及造血相關轉錄因子RUNX1的表觀調(diào)控維度，揭示了HSC起源的命運決定機制。

為了探究哺乳動物胚胎中多維表觀遺傳層級如何調(diào)控HSC發(fā)生這一科學問題，該研究突破了少量細胞檢測的技術瓶頸，應用少量細胞sisHi-C（small-scale in situ Hi-C）技術³和何愛彬團隊于2019年開發(fā)的少量細胞itChIP-seq（indexing and tagmentation-based chromatin immunoprecipitation sequencing）技術⁴，分別在數(shù)百個細胞中，檢測染色質互作結構、組蛋白修飾及轉錄因子結合圖譜。作者從小鼠胚胎的主動脈-性腺-中腎區(qū)和胎肝中分別收集了HSC發(fā)育路徑上相鄰的四種細胞類型：eAEC、HEC、pre-HSC以及LT-HSC（圖1）。結合團隊近期發(fā)表的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)^{1, 2}，以大范圍到小范圍的不同層級染色質空間結構發(fā)育變化為主線，進行HSC起源的多維表觀遺傳調(diào)控機制解析。

圖1.細胞樣品示意圖及多維表觀調(diào)控檢測

促進造血發(fā)生的染色質互作變化發(fā)生在拓撲結構域（topologically associated domain, TAD）內(nèi)部。在大尺度的染色質區(qū)室層級（100 Mbp），基因組被劃分為轉錄活躍性高的A類區(qū)室和轉錄活躍性低的B類區(qū)室。僅有約10.78%的基因組區(qū)域存在任兩個時期之間的A/B類區(qū)室互換的現(xiàn)象。TAD為染色質區(qū)室的下一級結構，其邊界富集了H3K4me3信號，存在阻隔強度的動態(tài)變化，但并未直接影響TAD邊界附近基因的表達。而進一步探究發(fā)現(xiàn)，TAD內(nèi)部的調(diào)控元件互作及伴隨的組蛋白修飾變化，直接與造血發(fā)育進程相關。

HSC特異的增強子在eAEC中已經(jīng)處于一定程度的激活狀態(tài)。與以往的從無到有的增強子激活認知不同的是，在EHT初期的eAEC中，造血過程相關TAD中的增強子已經(jīng)顯著富集激活性組蛋白修飾（H3K27ac和H3K4me1）。從eAEC經(jīng)過HEC，到pre-HSC，增強子的活性信號并沒有變化，僅在pre-HSC至LT-HSC這一階段才進一步增強。這提示在eAEC中，已經(jīng)初步準備好了造血發(fā)生的相關染色質修飾基礎，但需要染色質互作結構及轉錄因子的結合，驅動促進HSC產(chǎn)生（圖2）。

染色質互作在早期變化最顯著。EHT初期（eAEC-HEC），TAD內(nèi)部染色質互作大幅度變化，造血相關基因所在區(qū)域的互作顯著增強。在EHT末期pre-HSC到LT-HSC轉變中，TAD內(nèi)互作只是小幅度增強，但標記活性增強子的組蛋白修飾H3K27ac則一定程度顯著提升。整個過程中，相應的抑制性組蛋白修飾H3K27me3逐步減弱，為造血發(fā)生創(chuàng)造活躍染色質環(huán)境（圖2）。

圖2.HSC發(fā)生的多維表觀遺傳層級調(diào)控示意圖

令人意外的是發(fā)現(xiàn)早在eAEC時期，RUNX1蛋白已富集結合于增強子-啟動子（E-P）互作的錨點區(qū)域。RUNX1 是一個重要造血發(fā)育相關轉錄因子⁵，一般認為它為驅動HSC的發(fā)生所必須，其表達時間與HSC一致，它的缺失會造成胚胎造血異常或致死^{6, 7}。受限于檢測技術對細胞數(shù)目的要求，很多已有研究只能使用體外分化樣品或細胞系進行RUNX1的ChIP-seq實驗^{8, 9, 10}，以探究RUNX1如何調(diào)控HSC細胞命運。利用新開發(fā)的高靈敏度itChIP-seq技術，該研究以100-500個分選細胞為起始樣品，檢測了eAEC、HEC、pre-HSC和LT-HSC的RUNX1全基因組結合圖譜。研究發(fā)現(xiàn)，HSC發(fā)生過程中，RUNX1參與了約40.9%的E-P互作。其中，互作強度暫時或持續(xù)上升的E-P互作與造血及免疫過程顯著相關（圖3）?；赗UNX1結合互作的啟動子及增強子區(qū)域，該研究預測出與RUNX1協(xié)同調(diào)控染色質互作的其它轉錄因子，如GFI1b、PU.1、IRF家族蛋白、SMAD家族蛋白等。該預測結果為RUNX1協(xié)同其它轉錄因子共同調(diào)控EHT的機制探究提供了指示方向。

圖3. RUNX1參與增強子-啟動子(E-P)互作及調(diào)控相關生物學過程

該研究突破了體內(nèi)樣品細胞數(shù)目限制的技術瓶頸，整合了多層級染色質結構、不同組蛋白修飾及轉錄因子RUNX1的多組學數(shù)據(jù)，揭示了HSC起源的表觀遺傳層級調(diào)控新機制。

北京大學未來技術學院分子醫(yī)學研究所博士李晨、軍事科學院博士生張廣雨為論文共同第一作者。何愛彬教授、劉兵研究員（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心）、蘭雨研究員（暨南大學）為本文共同通訊作者。感謝清華大學頡偉教授對sisHi-C技術的分享。該研究獲得了科技部干細胞專項、國家自然科學基金委、廣東省重點研究開發(fā)項目、北京大學生命科學聯(lián)合中心、北京大學高性能計算中心和生命科學學院鳳凰平臺的大力支持。

北京大學未來技術學院分子醫(yī)學研究所何愛彬實驗室主要開發(fā)單細胞/痕量細胞水平的表觀遺傳學檢測技術，以及單細胞實時成像技術，長期誠聘博士后，歡迎發(fā)育生物學、表觀遺傳學、生物信息學、光學等背景的博士加入實驗室。

參考文獻：

1.Hou S, et al. Embryonic endothelial evolution towards first hematopoietic stem cells revealed by single-cell transcriptomic and functional analyses. Cell Res30, 376-392 (2020).

2.Zhou F, et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution. Nature533, 487-492 (2016).

3.Du Z, et al. Allelic reprogramming of 3D chromatin architecture during early mammalian development. Nature547, 232-235 (2017).

4.Ai S, et al. Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq. Nat Cell Biol21, 1164-1172 (2019).

5.Chen MJ, Yokomizo T, Zeigler BM, Dzierzak E, Speck NA. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature457, 887-891 (2009).

6.Lacaud G, et al. Runx1 is essential for hematopoietic commitment at the hemangioblast stage of development in vitro. Blood100, 458-466 (2002).

7.Yokomizo T, et al. Runx1 is involved in primitive erythropoiesis in the mouse. Blood111, 4075-4080 (2008).

8.Wilson NK, et al. Combinatorial transcriptional control in blood stem/progenitor cells: genome-wide analysis of ten major transcriptional regulators. Cell Stem Cell7, 532-544 (2010).

9.Gilmour J, Assi SA, Noailles L, Lichtinger M, Obier N, Bonifer C. The Co-operation of RUNX1 with LDB1, CDK9 and BRD4 Drives Transcription Factor Complex Relocation During Haematopoietic Specification. Sci Rep8, 10410 (2018).

10.Nottingham WT, et al. Runx1-mediated hematopoietic stem-cell emergence is controlled by a Gata/Ets/SCL-regulated enhancer. Blood110, 4188-4197 (2007).

來源：北京大學