浙大校友揭示DNA損傷又一機制，自學Python實現(xiàn)追蹤DNA復制“許可”動態(tài)，為抗腫瘤藥物研發(fā)提供新思路
“新冠疫情造成了研究遲緩。不過在那段時間，我有大量的 Bench-free Time，自學了 Python 語言，后來已經(jīng)可以獨立寫代碼分析數(shù)據(jù)，這反而加速了后來的研究，也算是彌補了因疫情導致的延緩?！彪m然是藥理學博士，但浙大校友梅柳竟然自己學會了計算機編程語言 Python。
Python 也助力她發(fā)表了一篇頂刊論文，完成發(fā)論文這件大事之后，33 歲的梅柳即將迎來另一件大事——成為一名媽媽。
圖 | 梅柳（來源：梅柳）
在半個月前發(fā)表的論文中，利用首創(chuàng)的分析 MCM 加載動態(tài)的方法，她和團隊首次將活細胞成像技術(shù)與固定細胞免疫熒光成像技術(shù)，聯(lián)合用于檢測單細胞水平 MCM 復合體在人類亞細胞核內(nèi)的加載動態(tài)，填補了該復合體在不同染色質(zhì)環(huán)境的加載動態(tài)研究的空白。其中，MCM 的全稱是 Minichromosome Maintenance Protein Complex，指的是微染色體維持蛋白復合體。
1 月 26 日，相關(guān)論文以《在不同染色質(zhì)環(huán)境中起源許可動態(tài)差異的后果》（The consequences of differential origin licensing dynamics in distinct chromatin environments）為題，發(fā)表在 Nucleic Acids Research（IF 16.971）上[1]。目前，梅柳在北卡羅萊納大學教堂山分校生物化學與生物物理系做博后研究，是此次論文的第一作者。
圖 | 相關(guān)論文（來源：Nucleic Acids Research）
細胞周期第一階段的晚期，對異染色質(zhì) MCM 加載極為重要
一般來講，細胞在每次分裂之前都要完成 DNA 復制，以確保分裂之后每個后代細胞仍然含有與母細胞數(shù)量相同的 DNA，只有這樣才能保證遺傳穩(wěn)定性。
但在 DNA 復制之前，細胞得先給部分 DNA 發(fā)放復制“起源許可”，這樣一來 DNA 只能在獲得許可的位置開啟復制。DNA 復制許可（DNA Replication Licensing）假說認為，染色質(zhì) DNA 在細胞分裂發(fā)生之前精確復制、且僅復制一次的過程中，“起源許可”的作用至關(guān)重要。
細胞內(nèi)所有 DNA 都必須被復制，無論是處于致密的異染色質(zhì)環(huán)境，還是處于疏松的常染色質(zhì)環(huán)境。這意味著在有限的 DNA 復制準備時間內(nèi)，也就是在 G1 期之內(nèi)（G1 phase，一個細胞周期的第一階段），所有 DNA 都要獲得合適的起源許可。
已有研究發(fā)現(xiàn)，起源許可數(shù)量不足、或分布不均，都會導致染色體遺傳的不穩(wěn)定。對于“起源許可”的生化過程、即 MCM 復合體的 DNA 加載來說，此前已有大量詳實報道。
（來源：Nucleic Acids Research）
但是，關(guān)于這一過程本身對于染色質(zhì)環(huán)境是否具有偏好性、或優(yōu)先級的研究，目前尚未報道。
而在該研究中，梅柳通過向人視網(wǎng)膜色素上皮細胞導入帶有不同熒光的細胞周期追蹤蛋白，并使用活細胞成像記錄細胞的生長周期。
在活細胞成像結(jié)束后，梅柳又通過特殊試劑去除游離的 MCM 并固定細胞，隨后進行 MCM 以及染色質(zhì)標簽的免疫熒光染色實驗，并通過高分辨率共聚焦顯微鏡、對單個不同時期的 G1 期細胞進行多層次 3D 成像。
這時根據(jù)活細胞成像記錄，即可知曉每個細胞的分裂史、以及所處時期；而根據(jù)固定細胞免疫熒光成像，則可獲得 MCM 復合體的亞細胞核加載的數(shù)量。
綜合兩者得到的信息，即可繪制出 MCM 在不同 DNA 復制準備時期、以及不同染色質(zhì)區(qū)域的加載量，從而得到 MCM 的加載動態(tài)。
基于以上方法，梅柳發(fā)現(xiàn)在 G1 早期異染色質(zhì)加載 MCM 復合體的速率低于常染色質(zhì)，然而在 G1 晚期異染色質(zhì)與常染色加載 MCM 速率相當。
（來源：Nucleic Acids Research）
基于此現(xiàn)象她推測，相比常染色質(zhì)來說，G1 晚期對于異染色質(zhì)加載足量 MCM 更重要。為驗證這一假設，梅柳通過誘導表達細胞周期蛋白 cyclin E 從而縮短 G1 期長度，迫使細胞過早進入 DNA 復制期也就是 S 期（S phase，即 DNA 合成期）。
在這些具有極短 G1 期的細胞中，其 G1 晚期異染色質(zhì) MCM 加載不足的現(xiàn)象顯著高于常染色質(zhì)。在隨后的 G2 期，這些具有極短 G1 期的細胞核內(nèi)異染色質(zhì)的 DNA 損傷程度，明顯高于正常細胞。而在兩組細胞中，常染色質(zhì)的 DNA 損傷則無明顯差異。
進一步研究發(fā)現(xiàn)，導致常染色質(zhì)和異染色質(zhì) MCM 加載動態(tài)的差異，部分源于 ORCA 蛋白在常染色質(zhì)和異染色質(zhì)在 G1 不同時期的分布差異，進而導致了所招募的 ORC 的分布差異。
梅柳表示：“我們的研究首次發(fā)現(xiàn)：相較于常染色質(zhì)，異染色質(zhì)許可在 G1 期相對延后，這意味 G1 晚期對于異染色質(zhì) MCM 加載極為重要。而這一特殊的許可動態(tài)，決定了在 G1 期異?？s短的細胞中比如原癌基因激活或抑癌基因丟失的細胞，異染色質(zhì)極易因為遭受許可不足，而導致基因組不穩(wěn)定性增加。因此，完整的 G1 期對于維持基因組的穩(wěn)定性極其重要?！?/p>
（來源：Nucleic Acids Research）
回顧研究步驟，她表示首先是提出立題依據(jù)，其所在實驗室對于“起源許可”的研究經(jīng)驗比較豐富，此前該實驗室的博士生雅各布·馬特森（Jacob Matson）發(fā)現(xiàn)，干細胞的“起源許可”速度明顯快于已分化細胞。
相比分化細胞，干細胞的染色質(zhì)環(huán)境通常更為疏松。這些背景促使梅柳和團隊提出如下研究假設：疏松的常染色質(zhì)和致密的易染色質(zhì)，是否也在“起源許可”過程中存在差異？如果存在差異，那么對細胞有怎樣的意義？其中的分子機制又是如何？
有了假設，就要建立實驗方法，這一過程非常耗時。因為細胞中的 MCM 大部分游離于細胞中，只有一部分 MCM 會加載到 DNA 上，且加載過程是單向不可逆的，而目前并沒有任何可用的實時 MCM 加載追蹤標記物。
為了研究 MCM 加載動態(tài)，梅柳不得不先依靠活細胞成像技術(shù)，去獲取大量單個細胞的“分子年齡”，并通過免疫熒光染色及共聚焦 3D 成像，進一步測量單個細胞 MCM 加載情況，以根據(jù)這些信息繪制出 MCM 在不同亞細胞核內(nèi)的加載動態(tài)。
同時，大量單細胞成像的數(shù)據(jù)分析也十分復雜，梅柳的合作伙伴通過各種調(diào)試，開發(fā)出一系列 Python 源代碼，這時終于實現(xiàn)了在不同染色質(zhì)環(huán)境內(nèi)，對批量單細胞 MCM 的定量分析。
（來源：Nucleic Acids Research）
接下來，便是實驗實施和結(jié)論得出的階段。
期間，梅柳對比了 MCM 在常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的加載動態(tài)，發(fā)現(xiàn) MCM 在異染色質(zhì)的加載過程相對延后，但是最終進入 DNA 復制期時，單位含量 DNA 的 MCM 加載數(shù)量相當。
進一步研究后，她發(fā)現(xiàn)如果人為縮短 G1 期，會導致異染色質(zhì)的 DNA 損傷，不過并不會對常染色質(zhì)產(chǎn)生影響。這說明，對于維持基因組的穩(wěn)定性來說，合適長度的 G1 期的極其重要。此外，梅柳還發(fā)現(xiàn)了 MCM 在常染色質(zhì)和異染色質(zhì)加載差異的分子機制。
（來源：Nucleic Acids Research）
疫情導致研究延遲，“被迫”學會 Python 編程
概括來說，此次研究揭示了縮短 G1 期可導致 DNA 的損傷的其中一個原因。如果開發(fā)出可以明顯縮短 G1 期的藥物、并用于 G1 期較長的腫瘤細胞，就能損傷腫瘤細胞的 DNA，從而促進腫瘤細胞的凋亡。
“也就是說，我們?yōu)閷砜鼓[瘤藥物的研發(fā)提供了一種新的角度和理論依據(jù)?！泵妨硎?。
同時，她也坦言研究遇到了許多挑戰(zhàn)，尤其首創(chuàng)的追蹤 MCM 加載動態(tài)的方法。期間嘗試了許多方法，才優(yōu)化出最好的方法。
其中一個挑戰(zhàn)是活細胞成像在普通熒光顯微鏡下完成，而固定染色后的細胞最終成像要在另一臺共聚焦顯微鏡下完成。
她遇到的難題之一是如何在共聚焦顯微鏡下找到活細胞成像時記錄的細胞，為此梅柳最開始應用了底部帶有網(wǎng)格標記的培養(yǎng)皿，每次都能根據(jù)網(wǎng)格位置找到目的細胞群，但是這種培養(yǎng)皿價格昂貴且只能做一組實驗。
經(jīng)過與該校顯微鏡中心專業(yè)人士的多次討論，最終決定使用普通活細胞成像的培養(yǎng)板，但是需要人為在板底標記一個特殊位置，并設置該位點的坐標軸為（0，0），這意味著其他成像位點相對于該標記也有了自己的相對坐標。如此一來，無論將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移到任何顯微鏡下，都可根據(jù)這些坐標找到初始成像位點。
對于后續(xù)計劃，她表示該研究的實驗手段仍有改進空間。接下來可能會在檢測手段上進一步優(yōu)化，或采用完全不同的手段，比如利用 DNA 成像技術(shù)以便更精確地揭示不同染色質(zhì)環(huán)境下的 MCM 加載動態(tài)。
（來源：Nucleic Acids Research）
“我是有回國打算的”
梅柳是黑龍江海林人，本科畢業(yè)于黑龍江八一農(nóng)墾大學制藥工程專業(yè)；碩士畢業(yè)于哈爾濱醫(yī)科大學藥理學專業(yè)，師從楊寶峰院士，期間她主要研究心血管疾??；博士畢業(yè)于浙江大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學專業(yè)，師從吳希美教授，博士期間以第一作者發(fā)表高質(zhì)量 SCI 論文兩篇（Cancer Letters, 2016; Oncogene, 2021）。
其表示：“我在博士期間的主要工作，在于首次鑒定了 Hippo 信號通路的關(guān)鍵激酶 LATS1 的 SUMO 化修飾，對于 LATS1 激酶活性的調(diào)控至關(guān)重要，并且發(fā)現(xiàn)這一修飾決定了 LATS1 的生物學功能的多樣性?！?/p>
在博士期間，梅柳曾多次獲得“優(yōu)秀研究生”稱號并獲得國家獎學金一次。目前，她在美國北卡羅萊納大學教堂山分校生物化學與生物物理系從事博士后研究，導師為簡·庫克（Jean Cook）教授，研究方向為細胞周期調(diào)控機制。
目前國內(nèi)對科研越來越重視，科研環(huán)境也越來越越好。對于博后出站后的安排，她說：“我是有回國打算的，打算一邊找工作一邊把手上目前在研的課題做完?！?/p>
-End-
參考：
1、Mei, L., Kedziora, K. M., Song, E. A., Purvis, J. E., & Cook, J. G. (2022). The consequences of differential origin licensing dynamics in distinct chromatin environments.Nucleic Acids Res.
來源：麻省理工科技評論
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