蛋白功能的發(fā)揮需要其在不同構象之間進行轉變。雖然目前結構生物學對蛋白結構的解析已經(jīng)能夠達到原子分辨率，但所獲得的蛋白結構仍主要以占比較高的低能態(tài)為主。蛋白在功能發(fā)揮的過程中存在一些瞬時的、高自由能的亞態(tài)，獲取關于這些亞態(tài)的信息對于充分理解蛋白作用機制具有重要意義，但目前的技術手段在捕捉這些瞬時結構上仍存在局限性。
2022年3月2日，布蘭迪大學Dorothee Kern課題組于Nature發(fā)表題為Structure determination of high-energy state in a dynamic protein ensemble的研究論文，通過結合NMR假接觸化學位移 (pseudocontact chemical shift, PCS) 和Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) 弛豫彌散 (PCS-CPMG) 對蛋白瞬時的高能態(tài)進行結構解析，同時確定了蛋白在功能發(fā)揮過程中伴隨構象變化而產(chǎn)生的動力學或熱力學改變。利用NMR解析蛋白高能態(tài)的高分辨率結構-肽度TIMEDOO
相比于X射線晶體學和冷凍電鏡，NMR在解析蛋白高能態(tài)結構中具有一定的優(yōu)勢，通過核極化效應 (nuclear Overhauser effect, NOE)、殘留偶極耦合 (residual dipolar coupling, RDC)、順磁弛豫增強 (paramagnetic relaxation enhancement, PRE) 及PCS等對結構進行進一步約束，可以使所獲得的結構信息更為準確1-3。但在實際應用NMR解析高能態(tài)結構時仍存在諸多困難，譬如，化學位移雖曾被用于解析小蛋白（小于150個氨基酸）的高能態(tài)結構，但在將化學位移與結構相關聯(lián)時仍存在較大的不確定性4。本文所使用的方法主要依賴于PCS，能在結構解析時提供長程的約束。PCS定義為反磁化學位移與順磁化學位移之間的差值，相比于化學位移能提供更多的三級結構以及結構域之間的信息。此外，PCS與弛豫彌散的偶聯(lián)，使得彌散效應更顯著且可調(diào)控。

腺苷酸激酶 (adenylate kinase, Adk) 的構象變化與其酶促反應周期密切相關，其低能態(tài)的閉合狀態(tài)在晶體結構中已被解析，但高能的活化狀態(tài)的存在只被間接證實。利用PCS-CPMG，研究人員發(fā)現(xiàn)Adk催化核心及AMP lid部分表觀PCS的變化更大，提示高能態(tài)中ATP lid和AMP lid處于開放狀態(tài)，且這一開口的大小實際小于此前的認知5（圖1）。

利用NMR解析蛋白高能態(tài)的高分辨率結構-肽度TIMEDOO
圖1. Adk在催化過程中的不同狀態(tài)及其在順磁和反磁
情況下的彌散狀態(tài)
對實驗獲得的1HNCPMG數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)在高能狀態(tài)下，AMP lid開口大約為15°，與閉合狀態(tài)更為相似。由于實驗中ADP濃度為飽和狀態(tài)，這一高能態(tài)的結構應當是被底物或產(chǎn)物完全占據(jù)的，因而這一結構較好地揭示了Adk為產(chǎn)物的釋放做準備的過程（圖2），解釋了底物結合和產(chǎn)物釋放過程中的構象選擇及誘導-適應。利用NMR解析蛋白高能態(tài)的高分辨率結構-肽度TIMEDOO
圖2. Adk高能態(tài)的結構及其在催化反應中的構象變化
不同于Adk，大多數(shù)蛋白不具備順磁金屬結合的位點，為了證明PCS-CPMG這一方法在蛋白高能態(tài)結構的研究中具備一定的普適性，作者進一步在鈣調(diào)蛋白 (calmodulin) 和Src激酶的模擬數(shù)據(jù)中對這一方法進行測試。對于calmodulin來說，可以采用鑭系金屬替代其所結合的Ca2+，而對于Src激酶來說，可以引入能夠結合鑭系金屬的分子標簽，通過這樣的策略，PCS-CPMG的使用范圍得到了拓展（圖3）。
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?圖3. PCS-CPMG在其他蛋白中的應用，左圖為calmodulin，右圖為Src激酶

綜上所述，對于分子量在60 kDa以下的蛋白，且高能態(tài)占比低至該蛋白整體的0.5%時，PCS-CPMG在確定高能態(tài)的結構方面具有較大的優(yōu)勢。在未來，隨著方法學上的進一步優(yōu)化，蛋白不同構象結構的解析應當會變得更加便捷。
原文鏈接
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04468-9
參考文獻
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4.Nerli, S., McShan, A. C. & Sgourakis, N. G. Chemical shift-based methods in NMR structure determination. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 106-107, 1–25 (2018).

5.Aviram, H. Y. et al. Direct observation of ultrafast large-scale dynamics of an enzyme under turnover conditions. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 3243–3248 (2018).

來源： 結構生物學高精尖創(chuàng)新中心