北京大學(xué)物理學(xué)院凝聚態(tài)物理與材料物理研究所、人工微結(jié)構(gòu)和介觀物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家生物醫(yī)學(xué)成像科學(xué)中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、定量生物學(xué)中心毛有東教授團(tuán)隊(duì)利用自主研發(fā)的深度學(xué)習(xí)高精度四維重建技術(shù)，發(fā)展并應(yīng)用時(shí)間分辨冷凍電鏡，闡明了原子水平人源蛋白酶體動(dòng)力學(xué)調(diào)控和構(gòu)象重編程機(jī)制。2022年4月27日，相關(guān)研究成果以《時(shí)間分辨冷凍電鏡解析人源蛋白酶體在USP14調(diào)控下的變構(gòu)》（“USP14-regulatedallostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”）為題，在線發(fā)表于國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《自然》（Nature）。

同期，研究人員、審稿人和Nature編輯團(tuán)隊(duì)聯(lián)合，在研究簡(jiǎn)報(bào)（Research Briefing）專(zhuān)欄在線發(fā)表了題為《人體蛋白質(zhì)降解機(jī)制的控制揭示》（“Control of human protein-degradation machinery revealed”）的推介文章，其中審稿人評(píng)價(jià)“該工作是一項(xiàng)重大研究，終于在原子水平解決了USP14活化和其調(diào)控蛋白酶體功能的機(jī)制問(wèn)題”；Nature編輯團(tuán)隊(duì)指出“這一工作通過(guò)時(shí)間分辨冷凍電鏡，結(jié)合功能分析……呈現(xiàn)了蛋白質(zhì)降解過(guò)程中USP14和蛋白酶體的構(gòu)象連續(xù)體”。這是首次將人工智能四維重建技術(shù)應(yīng)用于大幅提升時(shí)間分辨冷凍電鏡分析精度，針對(duì)重大疾病靶蛋白復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)原子水平功能動(dòng)力學(xué)觀測(cè)的國(guó)際領(lǐng)先原創(chuàng)成果，展示了一類(lèi)新型的蛋白質(zhì)復(fù)合動(dòng)力學(xué)研究范式。

蛋白質(zhì)降解調(diào)控是極其重要的基本生物化學(xué)過(guò)程，在細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫響應(yīng)、基因調(diào)控、新陳代謝、神經(jīng)退行、癌癥腫瘤、病毒感染以及蛋白毒性響應(yīng)等主要細(xì)胞分子過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在真核細(xì)胞中，絕大部分胞內(nèi)蛋白都是通過(guò)泛素蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway），經(jīng)過(guò)泛素化標(biāo)記被蛋白酶體全酶降解的。2004年，Aaron Ciechanover，Irwin Rose和AvramHershko三位科學(xué)家因“對(duì)該泛素化通路介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的歷史性發(fā)現(xiàn)”被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。蛋白酶體全酶，又稱(chēng)為26S proteasome，是由中間一個(gè)圓柱形20S核心顆粒和兩端覆蓋的一個(gè)或兩個(gè)19S調(diào)節(jié)顆粒組成。19S包含一個(gè)環(huán)形異源六聚體馬達(dá)——AAA-ATPase，通過(guò)多個(gè)協(xié)同ATP水解模式調(diào)控蛋白酶體降解泛素化底物。蛋白酶體功能紊亂與人體多種疾病相關(guān)，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和免疫疾病等。蛋白酶體是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的多種治療癌癥的上市小分子藥物的直接靶標(biāo)。在正常細(xì)胞中，蛋白酶體的功能受到多個(gè)水平的嚴(yán)格調(diào)控。去泛素化酶USP14是最主要的蛋白酶體調(diào)控分子，被認(rèn)為是一個(gè)潛力巨大的治療癌癥和神經(jīng)退行性疾病的重要靶標(biāo)，其小分子抑制劑曾進(jìn)入過(guò)美國(guó)一期臨床研究，但圍繞USP14功能機(jī)制的一系列懸而未決的關(guān)鍵問(wèn)題極大地限制了其靶向藥物分子的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用。USP14通過(guò)結(jié)合26S而被激活，然后以毫秒的時(shí)間尺度剪切底物上的泛素鏈；但其如何被蛋白酶體激活并調(diào)控蛋白酶體功能，一直是全球研究機(jī)構(gòu)和生物制藥領(lǐng)域期待解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。

生命分子機(jī)器通過(guò)高度復(fù)雜的非平衡動(dòng)力學(xué)過(guò)程和結(jié)構(gòu)變化來(lái)實(shí)現(xiàn)其特殊功能，這一過(guò)程進(jìn)而受到各種復(fù)雜分子間相互作用的精準(zhǔn)調(diào)控。如何在原子水平直接觀察天然態(tài)超大分子機(jī)器的功能態(tài)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，給現(xiàn)有的原子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)分析技術(shù)提出了空前挑戰(zhàn)。

毛有東教授團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于發(fā)展基于冷凍電鏡的動(dòng)力學(xué)重建方法，圍繞蛋白酶體、炎癥小體等具有重大臨床應(yīng)用前景的靶點(diǎn)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能、動(dòng)力學(xué)機(jī)制和靶向調(diào)控分子設(shè)計(jì)深入開(kāi)展前沿交叉研究：2016年，在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》（PNAS）上報(bào)道了人源蛋白酶體基態(tài)的3.6 ?冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及其他三個(gè)亞納米分辨構(gòu)象，并首次發(fā)現(xiàn)一個(gè)亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象的核心顆粒物轉(zhuǎn)運(yùn)通道處于開(kāi)放狀態(tài)（PNAS 2016; 113: 12991-12996）；2017年，利用冷凍電鏡解析高分辨率蛋白酶體19S調(diào)控復(fù)合體在結(jié)合組裝伴侶p28的自由態(tài)的三維結(jié)構(gòu)，闡釋了組裝伴侶蛋白Gankyrin/p28在蛋白酶體組裝過(guò)程中構(gòu)象選擇的組裝機(jī)理（Molecular Cell 2017; 67: 322-333）；2018年4月，在《自然·通訊》（Nature Communications）上報(bào)道了6個(gè)ATPγS結(jié)合狀態(tài)下的26S蛋白酶體動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，包括三個(gè)核心顆粒復(fù)合物開(kāi)放態(tài)對(duì)應(yīng)的亞穩(wěn)簡(jiǎn)并態(tài)近原子分辨（4~5 ?）結(jié)構(gòu)（Nature Communications 2018, 9: 1360）；2018年11月，在《自然》（Nature）上首次報(bào)道了人源蛋白酶體26S在降解底物過(guò)程中的七種中間態(tài)構(gòu)象的高分辨（2.8~3.6?）結(jié)構(gòu)，在原子水平呈現(xiàn)了蛋白酶體和底物相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)AAA-ATPase六聚馬達(dá)分子內(nèi)ATP水解全周循環(huán)的完整過(guò)程的原子水平觀測(cè)（Nature 2019; 565: 49-55）。這一系列工作揭示了蛋白酶體的原子架構(gòu)、組裝原理和降解泛素化底物的動(dòng)力學(xué)基本規(guī)律。

(A) USP14調(diào)控下蛋白酶體復(fù)合體降解多泛素化底物的原子結(jié)構(gòu)模型之一；(B) 時(shí)間分辨率冷凍電鏡解析13種中間態(tài)的統(tǒng)計(jì)分布隨蛋白質(zhì)降解進(jìn)程的時(shí)間演化（Youdong Mao, CC BY 4.0）

科學(xué)研究的過(guò)程總是艱難曲折，要克服的首要困難是“時(shí)間分辨”：蛋白酶體降解底物的過(guò)程很快，時(shí)間尺度在毫秒至秒之間，正常條件下，想要通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)捕獲此過(guò)程的中間態(tài)結(jié)構(gòu)非常困難，因此，首先要讓這個(gè)過(guò)程慢下來(lái)。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)大量的條件摸索，重建反應(yīng)動(dòng)力學(xué)體系和優(yōu)化反應(yīng)條件，包括優(yōu)化緩沖體系、反應(yīng)溫度等條件，優(yōu)化出較為可行的實(shí)驗(yàn)方案，從而使得時(shí)間分辨冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用成為可能，最終獲得了含時(shí)的45,193張USP14-26S復(fù)合體降解泛素底物過(guò)程中的冷凍電鏡透射圖樣，挑取了3,556,806個(gè)USP14-26S-泛素底物復(fù)合體的顆粒圖像。

接下來(lái)面臨的極端挑戰(zhàn)是“三維分類(lèi)”，冷凍電鏡捕獲的復(fù)合體圖像需要經(jīng)過(guò)一系列的分類(lèi)，將它們歸為不同的構(gòu)象類(lèi)別，才能呈現(xiàn)出蛋白反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。USP14結(jié)合到26S蛋白酶體后，使得降解底物的動(dòng)力學(xué)過(guò)程更加復(fù)雜，想要在如此多的異構(gòu)復(fù)合體顆粒圖像中，鑒別出降解過(guò)程的各個(gè)時(shí)態(tài)的高分辨率非平衡構(gòu)象，傳統(tǒng)的三維分類(lèi)方法是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。低精度的三維分類(lèi)將導(dǎo)致低分辨的三維重建，從而無(wú)法獲取原子水平的動(dòng)力學(xué)信息，無(wú)法對(duì)含時(shí)的數(shù)據(jù)賦予自洽的動(dòng)態(tài)變化的物理意義。研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合經(jīng)過(guò)數(shù)年自主開(kāi)發(fā)的新型深度學(xué)習(xí)高精度三維分類(lèi)和四維重建方法，捕獲了USP14-26S復(fù)合體降解多泛素化底物過(guò)程的13種不同功能中間狀態(tài)的高分辨率（3.0~3.6?）非平衡構(gòu)象，通過(guò)時(shí)間分辨冷凍電鏡分析，重建了受控蛋白酶體的完整動(dòng)力學(xué)工作周期，并結(jié)合分子生物學(xué)功能和基因突變研究，闡明了USP14和26S相互調(diào)控活性的原子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和非平衡動(dòng)力學(xué)機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)USP14的活化同時(shí)依賴于泛素識(shí)別和蛋白酶體RPT1亞基的結(jié)合。出人意料的是，USP14通過(guò)別構(gòu)效應(yīng)，誘導(dǎo)蛋白酶體同時(shí)沿著兩條并行狀態(tài)轉(zhuǎn)變路徑發(fā)生構(gòu)象變化；研究團(tuán)隊(duì)成功捕獲到了底物降解中間狀態(tài)向底物抑制中間狀態(tài)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。在底物降解途徑中，USP14活化變構(gòu)地重編程AAA-ATP酶馬達(dá)的構(gòu)象景觀（Conformational landscape）和統(tǒng)計(jì)分布，并刺激20S底物通道的打開(kāi)，從而觀察到底物持續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的ATPase六聚馬達(dá)非對(duì)稱(chēng)ATP水解和近乎完整的全周循環(huán)周期。USP14-ATPase的動(dòng)態(tài)相互作用，使得ATPase馬達(dá)底物識(shí)別與26S自身的去泛素化酶RPN11催化發(fā)生去耦合效應(yīng)，并在26S的泛素識(shí)別、底物的起始易位和泛素鏈回收過(guò)程中引入三個(gè)調(diào)控檢查點(diǎn)（動(dòng)力學(xué)分岔點(diǎn)）。這些發(fā)現(xiàn)為USP14調(diào)節(jié)26S的完整功能周期提供了全新的高分辨見(jiàn)解，并為USP14靶向藥物治療發(fā)現(xiàn)奠定了極為重要的機(jī)制基礎(chǔ)。

通過(guò)時(shí)間分辨冷凍電鏡分析獲取的USP14調(diào)控蛋白酶體底物降解的并行路徑模型（Youdong Mao, CC BY 4.0）

北京大學(xué)“博雅”博士后張書(shū)文和北京大學(xué)物理學(xué)院2019級(jí)博士研究生鄒士濤為論文的共同第一作者，毛有東為通訊作者。研究工作中的全部冷凍電鏡數(shù)據(jù)在北京大學(xué)電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)室和冷凍電鏡平臺(tái)上完成采集，大部分?jǐn)?shù)據(jù)分析工作在北京大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)上完成。

上述研究工作得到北京市自然科學(xué)基金、國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家杰出青年科學(xué)基金，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心等支持。

來(lái)源：北京大學(xué)