口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的主要類(lèi)型，惡性程度高，5年生存率為50%，是一種多階段漸進(jìn)惡變的惡性腫瘤，可從正常黏膜-癌前病變-癌演變而來(lái)，其中口腔白斑（OLK）是最常見(jiàn)的口腔癌前病變，口腔白斑惡變率可達(dá)11.7-23.1% [1,2]。因此，若能在癌前病變階段施加干預(yù)措施，則可有效預(yù)防口腔黏膜癌變，提高患者生存率。近年來(lái)，以抗PD-1抗體為核心的免疫治療在全身多種腫瘤治療中取得重要進(jìn)展，但在口腔鱗癌中應(yīng)答率不到20%，提示存在其它免疫逃逸途徑[3]。因此，需要對(duì)口腔癌變進(jìn)程中細(xì)胞類(lèi)型和分布的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行全面的表征，尋找該進(jìn)程中介導(dǎo)免疫逃逸的關(guān)鍵分子，為口腔鱗癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

2022年8月16日，中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的王智教授團(tuán)隊(duì)以及北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生命科學(xué)學(xué)院的白凡教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在The Journal of Clinical Investigation雜志發(fā)表題為T(mén)DO2⁺ myofibroblasts mediate immune suppression in malignant transformation of squamous cell carcinoma的研究論文。該研究采用單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)和體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞是介導(dǎo)T細(xì)胞免疫抑制的關(guān)鍵細(xì)胞亞群。

該研究對(duì)13例口腔鱗癌組織、3例白斑組織和8例癌旁正常組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，并對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行了V（D）J測(cè)序，共獲得131702個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞，最終定義了10個(gè)細(xì)胞亞群（圖1）。

圖1: 單細(xì)胞測(cè)序流程和主要細(xì)胞類(lèi)型

研究發(fā)現(xiàn)，隨著口腔癌變的進(jìn)展，CD4⁺ T細(xì)胞中靜止及活化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、耗竭CD4⁺ T細(xì)胞占比逐漸升高；具有高增殖能力的過(guò)渡態(tài)CD4⁺T細(xì)胞主要分化為活化的Tregs以及耗竭CD4⁺ T細(xì)胞（圖2A-D）。此外，研究者發(fā)現(xiàn)CD8⁺ T細(xì)胞存在終末耗竭、過(guò)渡耗竭和前體耗竭CD8⁺ T細(xì)胞亞群，并且在癌旁-癌前病變-癌組織中均呈逐漸升高的趨勢(shì)，前體耗竭及過(guò)渡耗竭CD8⁺ T細(xì)胞均朝向終末耗竭方向分化（圖2E-H）。以上結(jié)果顯示在口腔癌變過(guò)程中CD4⁺及CD8⁺ T細(xì)胞均存在表型轉(zhuǎn)換，其中CD4⁺ T細(xì)胞主要轉(zhuǎn)換為具有免疫抑制功能的Tregs，而CD8⁺T細(xì)胞則轉(zhuǎn)換為耗竭表型。

圖2: 口腔癌變進(jìn)程中CD4⁺/CD8⁺ T細(xì)胞的亞群分布和分化軌跡

為探究腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞是否可介導(dǎo)T細(xì)胞免疫抑制，研究者對(duì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)分群，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞中存在2群肌成纖維細(xì)胞亞群，兩個(gè)亞群均呈現(xiàn)在癌旁正常組織中缺失，在癌前病變和癌組織中逐漸增加的特征（圖3A-B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中一個(gè)亞群（MF-C1-TDO2，高表達(dá)TDO2和CXCL9）同時(shí)具有T細(xì)胞趨化和色氨酸代謝功能，而另一個(gè)亞群（MF-C2-ELN，高表達(dá)ELN）則具有基質(zhì)重塑功能（圖3C-G）。通過(guò)免疫熒光證實(shí)TDO2僅表達(dá)于癌組織的a-SMA⁺肌成纖維細(xì)胞中（圖3F），并且通過(guò)多色免疫組化（mIHC）染色證明其主要位于癌巢組織外圍（圖4A-D）。組織內(nèi)mIHC染色及體外高內(nèi)涵成像結(jié)果顯示該群TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)的T細(xì)胞趨化功能（圖4E-H）。

圖3: 口腔癌變進(jìn)程中肌成纖維細(xì)胞的亞群分布、功能差異和分化軌跡

圖4: TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞在口腔癌中的空間分布和體外高內(nèi)涵成像結(jié)果

上述結(jié)果顯示TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞位于癌巢外圍，并具有強(qiáng)烈的T細(xì)胞趨化功能，那么該群細(xì)胞是否介導(dǎo)T細(xì)胞免疫抑制呢？通過(guò)mIHC染色，研究者發(fā)現(xiàn)TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞周?chē)患嗟腡regs (Foxp3⁺CD4⁺)和耗竭 CD8⁺T 細(xì)胞（TIM-3⁺PD-1⁺ CD8⁺）。為進(jìn)一步探究TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的影響，研究者利用siRNA對(duì)口腔癌組織中分離的肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行TDO2基因敲低后，與CD4⁺/CD8⁺T細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示共培養(yǎng)體系中的Tregs和耗竭CD8⁺T細(xì)胞占比均降低，同時(shí)CD8⁺T細(xì)胞的殺傷功能增強(qiáng)。采用TDO2抑制劑LM10處理肌成纖維細(xì)胞可觀察到相似結(jié)果。此外，免疫組化染色結(jié)果顯示腫瘤間質(zhì)中高豐度TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞可提示口腔鱗癌患者預(yù)后較差（圖5）。

圖5: TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞對(duì)CD4⁺/CD8⁺T細(xì)胞的抑制作用

研究結(jié)果證明，雖然TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)的T細(xì)胞趨化功能，但是趨化而來(lái)的CD4⁺/CD8⁺T細(xì)胞出現(xiàn)明顯的免疫抑制狀態(tài)，提示該群肌成纖維細(xì)胞可能在癌巢外圍構(gòu)筑“陷阱”，通過(guò)TDO2催化的色氨酸代謝途徑，誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫抑制，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。該結(jié)果可部分解釋為何口腔黏膜惡變進(jìn)程中雖然病損內(nèi)有大量T細(xì)胞浸潤(rùn)，但仍出現(xiàn)PD-1治療抵抗的原因。

最后，研究者采用4NQO誘導(dǎo)小鼠口腔內(nèi)自發(fā)成瘤，并采用TDO2抑制劑LM10進(jìn)行體內(nèi)治療，結(jié)果顯示TDO2抑制劑可有效阻止小鼠口腔黏膜白斑惡變（圖6）。此外，采用小鼠口腔癌細(xì)胞進(jìn)行小鼠皮下成瘤，證實(shí)TDO2抑制劑聯(lián)合抗PD-1抗體在阻止口腔鱗癌進(jìn)展中有更好的效果（圖7A-B），而在裸鼠身上TDO2抑制劑沒(méi)有發(fā)揮作用（圖7C-D），提示TDO2抑制劑介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)呈T細(xì)胞依賴(lài)性。

圖7: TDO2抑制劑聯(lián)合抗PD-1抗體在阻止口腔鱗癌進(jìn)展中有更好的效果

該研究系統(tǒng)描繪了口腔黏膜癌變進(jìn)程中T細(xì)胞、髓系細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化圖譜，并發(fā)現(xiàn)在口腔癌巢外周TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)的T細(xì)胞趨化和抑制功能，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明抑制該群肌成纖維細(xì)胞可有效促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究為口腔鱗癌的免疫逃逸提出了新的機(jī)制，為阻斷口腔癌的發(fā)生發(fā)展提供了新的靶點(diǎn)。

圖8: TDO2⁺肌成纖維細(xì)胞是介導(dǎo)口腔癌中T細(xì)胞免疫抑制的關(guān)鍵亞群

中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的王智教授以及北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生命科學(xué)學(xué)院白凡教授是本文的共同通訊作者。北京大學(xué)BIOPIC、前沿交叉學(xué)科研究院的博士研究生胡思?jí)?、中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的盧渙滋博士、謝文強(qiáng)博士和王迪侃博士是本文的共同第一作者。該課題得到了科技部重大專(zhuān)項(xiàng)、廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃的資助。

論文鏈接
https://www.jci.org/articles/view/157649

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白凡，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心(BIOPIC)、北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心(ICG)、生命科學(xué)學(xué)院研究員，北京大學(xué)第一醫(yī)院兼職研究員，博士生導(dǎo)師，國(guó)家自然科學(xué)基金委優(yōu)秀青年科學(xué)基金、杰出青年科學(xué)基金獲得者。2003年本科畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，2008年獲得英國(guó)牛津大學(xué)生物物理博士學(xué)位，2008-2011年間先后在牛津大學(xué)、日本大阪大學(xué)從事博士后研究工作。

白凡實(shí)驗(yàn)室將綜合利用單分子熒光顯微成像技術(shù)、單細(xì)胞基因測(cè)序技術(shù)，研究與醫(yī)學(xué)臨床直接相關(guān)的前沿課題，包括：（1）單細(xì)胞基因測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于癌癥病人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究，探索癌癥轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制及無(wú)創(chuàng)癌癥診斷、預(yù)后判斷、療效評(píng)價(jià)的臨床方法；（2）大樣本基因測(cè)序研究中國(guó)人群高發(fā)癌癥的基因突變特征，發(fā)掘引起癌癥表型轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)事件；（3）研究細(xì)菌行為、致病性，抗生素殺菌原理和細(xì)菌抗藥、耐藥的分子機(jī)制。