哺乳動物卵母細(xì)胞的成熟是一個特殊的生物學(xué)過程，該過程中基因的轉(zhuǎn)錄被抑制，成熟過程主要受到mRNA翻譯的調(diào)控。目前卵子成熟的組學(xué)研究大都基于基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并不能真實的反應(yīng)卵子成熟過程中基因的翻譯表達(dá)水平。而翻譯組學(xué)的研究又需要大量的細(xì)胞作為材料或者需要表達(dá)純化標(biāo)簽，不能用于人卵母細(xì)胞的研究中。

為了全面揭示人卵子成熟過程中轉(zhuǎn)錄-翻譯雙組學(xué)圖譜。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院紀(jì)家葵課題組、中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖中心梁曉燕課題組及國內(nèi)多家生殖中心團(tuán)隊合作，開發(fā)出了適用于單個卵母細(xì)胞且不需要任何純化標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄-翻譯雙組學(xué)測序技術(shù)(T&T-seq)，可同時檢測單個卵母細(xì)胞樣本中的總mRNA及正在翻譯的mRNA（圖1），并進(jìn)一步研究人卵母細(xì)胞成熟的翻譯調(diào)控機(jī)制。該技術(shù)也適用于其他細(xì)胞類型，包括人胚腎細(xì)胞(293FT) 。除了首次揭示人卵轉(zhuǎn)錄-翻譯雙組學(xué)圖譜，該研究鑒定出OOSP2分泌蛋白對卵子的體外成熟具有促進(jìn)作用，為臨床輔助生殖技術(shù)提供新的技術(shù)手段。相關(guān)研究成果于2022年8月30日以“Single-cell transcriptome and translatome dual-omics reveals potential mechanisms of human oocyte maturation（單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄與翻譯雙組學(xué)揭示人卵母細(xì)胞成熟的潛在機(jī)制）”為題在線發(fā)表在Nature communications （自然-通訊）。

圖1.T&T-seq原理示意圖

該研究的主要發(fā)現(xiàn)如下：

1、利用T&T-seq技術(shù)，描繪了小鼠和人類卵母細(xì)胞成熟過程中的轉(zhuǎn)錄組和翻譯組圖譜

結(jié)果顯示，將T&T-seq中獲得的翻譯組學(xué)數(shù)據(jù)與最近使用100個人類GV或MII卵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。T&T-seq翻譯組能夠鑒定出大約高出10倍的翻譯基因數(shù)量并且需要更少的細(xì)胞使用量（圖2a）。作者分別對轉(zhuǎn)錄組和翻譯組的數(shù)據(jù)進(jìn)行了PCA聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組的 PCA 中卵母細(xì)胞和胚胎分離良好，但是GV和MII卵母細(xì)胞有部分重疊。相比之下，使用翻譯組的相同樣本的PCA清楚地分離了 GV 卵母細(xì)胞、MII 卵母細(xì)胞和胚胎，表明了翻譯組要比轉(zhuǎn)錄組更能夠表現(xiàn)GV和MII卵子之間的差異（圖2b）。為了進(jìn)一步了解轉(zhuǎn)錄組和翻譯組的全基因組變化，作者使用轉(zhuǎn)錄組和翻譯組同時分析了GV和MII卵母細(xì)胞中的差異基因。根據(jù)基因在卵子成熟過程中轉(zhuǎn)錄-翻譯組的表達(dá)水平，作者將這些基因進(jìn)行了分類。總體而言，大多數(shù)表達(dá)的基因在在卵子成熟過程中（I+III+IV+V 類）的轉(zhuǎn)錄水平保持不變或降低。這點(diǎn)與哺乳動物卵母細(xì)胞成熟過程中全基因組轉(zhuǎn)錄失活的傳統(tǒng)模型是一致的（圖2c-d）。此外，在成熟卵子中，基因的翻譯效率也要高于未成熟的卵子（圖2e，f）。

圖2. 卵子成熟過程中的轉(zhuǎn)錄-翻譯雙組學(xué)變化

2、揭示了人類卵子成熟過程中的時空順序調(diào)節(jié)

在未成熟的卵母細(xì)胞中，翻譯活躍的基因的功能主要是核糖體發(fā)生、線粒體合成、細(xì)胞質(zhì)翻譯等。而在成熟的卵子中，翻譯活躍的基因的功能主要是染色體分離、細(xì)胞周期調(diào)控、染色體修飾等（圖3）。這一結(jié)論揭示了卵母細(xì)胞成熟過程中基因表達(dá)從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的順序調(diào)節(jié)，在卵子發(fā)育的過程中，未成熟的卵子的基因主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能，成熟的卵子主要在細(xì)胞核中發(fā)揮功能，表明了卵子成熟的核質(zhì)不同步性。并且發(fā)現(xiàn)成熟卵子中的高翻譯效率的基因顯著多于未成熟卵子，體現(xiàn)了卵母細(xì)胞成熟過程中翻譯調(diào)控的重要性。

圖3. 卵子成熟過程中的時空順序調(diào)節(jié)

3、探究高翻譯的基因共有的翻譯調(diào)節(jié)元件

先前對小鼠的研究表明，卵母細(xì)胞成熟過程中的高翻譯表達(dá)受基因的3’UTR的RNA結(jié)合蛋白（RBP）結(jié)合的翻譯調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)(Chen et al., 2011; Sousa Martins et al., 2016; Yang et al., 2020)。然而，由于缺乏翻譯組數(shù)據(jù)集，尚未報道人類卵母細(xì)胞中的RBP的基序。因此，作者篩選了人類GV和MII卵母細(xì)胞中高翻譯效率[ TE（>1）] 基因的3′ UTR，來用于識別潛在的RBP識別基序，并尋找RBP作為潛在的翻譯調(diào)節(jié)因子。根據(jù)這些條件，作者篩選出了高TE MII基因中的RBP結(jié)合基序，他們分別是FXR1、PCBP1、DDX3X、CPEB2和CPEB4 的結(jié)合基序（圖4a）。此外，作者還鑒定出卵母細(xì)胞成熟相關(guān)的GO聚類中的高 TE基因，例如“染色體分離”、“減數(shù)分裂細(xì)胞周期”和“甲基化”（圖4b）。

圖4. 高翻譯基因3‘UTR富集出的RBP結(jié)合基序

4、比較小鼠與人類卵母細(xì)胞的翻譯組成熟過程中的表達(dá)模式

小鼠模型常用于研究和推斷人類卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制，然而，有一些獨(dú)特的翻譯表達(dá)模式可能只存在于人類卵母細(xì)胞中，僅用小鼠數(shù)據(jù)得出的結(jié)論可能不適用于人卵成熟。因此，基于小鼠和人類卵母細(xì)胞的T&T-seq，作者比較和對比了這兩個物種的翻譯組，鑒定出了一些不同翻譯模式的基因，例如OOSP蛋白家族的基因。在小鼠OOSP家族中，OOSP1和OOSP3蛋白都是在成熟過程中表達(dá)上調(diào)的，而OOSP2蛋白是在成熟過程中表達(dá)下調(diào)。然而在人的OOSP家族中卻正好相反。作者發(fā)現(xiàn)小鼠OOSP2基因只有一個PAS基序，而OOSP1和OOSP3均有多個與PAS基序相鄰的CPE基序。相比之下，人類OOSP2是唯一同時攜帶CPE和PAS的OOSP基因（圖5）。

圖5. CPE位點(diǎn)和PAS基序可能調(diào)控分泌蛋白的翻譯

5、發(fā)現(xiàn)添加OOSP2蛋白可以提高人卵體外成熟率，並揭示 OOSP2誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的分子機(jī)制

為了探究OOSP2是否對卵子的成熟具有調(diào)控作用，作者從捐贈者收集了GV卵母細(xì)胞，并使用帶有延時顯微鏡的孵化器來監(jiān)測卵母細(xì)胞的成熟。核膜破裂（GVBD）和極體排出（PBE）是在顯微鏡下卵母細(xì)胞成熟后形態(tài)變化的兩個階段（圖6）。當(dāng)觀察到 PBE 時，卵母細(xì)胞則被認(rèn)為是成熟的。在每組實驗中作者比較來自相同供體的成對 GV 卵母細(xì)胞，以消除不同供體的異質(zhì)性，并且分別記錄了實驗組和對照組卵子的GVBD的時間以及PBE的時間。作者發(fā)現(xiàn)添加OOSP2蛋白可以提高人卵體外成熟率。而添加OOSP2的抗體則會阻斷了OOSP2蛋白的功能，從而影響了卵子的成熟過程。

圖6. OOSP2蛋白可促進(jìn)人卵體外成熟

通過使用single-cell T&T-seq揭示了hRecOOSP2 處理過的GV期卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和翻譯組，鑒定OOSP2的潛在誘導(dǎo)基因或途徑。OOSP2可以直接調(diào)控下游基因的翻譯，并通過上調(diào)特定的信號通路，如小GTPase信號通路、細(xì)胞器定位通路等，來促進(jìn)卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟。擬時序分析也證明相比于未成熟卵子，OOSP2蛋白處理過的卵母細(xì)胞更接近于成熟卵子（圖7）。

圖7. OOSP2誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的分子機(jī)制

綜上所述，本研究開發(fā)出了適用于單個卵母細(xì)胞的T&T-seq，首次揭示人卵翻譯雙組學(xué)圖譜, 揭示了人類卵子成熟過程中的時空順序調(diào)節(jié); 揭示了小鼠和人類兩個物種的卵子成熟過程中的翻譯組學(xué)圖譜的異同; 闡釋了CPE基序?qū)β炎映墒爝^程中分泌蛋白翻譯的調(diào)控作用; 鑒定出OOSP2分泌蛋白對卵子的成熟具有重要的作用; 揭示了OOSP2可能通過調(diào)控小GTPase信號通路相關(guān)蛋白的翻譯來促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，為臨床卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)提供新的技術(shù)方法及理論依據(jù)。

清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2017級博士生胡文奇和中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖中心曾海濤主任醫(yī)師為該論文的并列第一作者，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院紀(jì)家葵教授和中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖中心梁曉燕教授為該論文的共同通訊作者。同濟(jì)大學(xué)上海第十人民醫(yī)院千日成教授課題組，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院崔毓桂教授課題組，山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院吳克良教授課題組，溫州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倪吳花副教授課題組共同參與該項目前期的研究工作。該項目得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)項目(2017YFC1001600)的支持。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-32791-2