2022年10月27日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院伊成器教授課題組聯(lián)合北大醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院王晶研究員課題組聯(lián)合在Nature Biotechnology雜志上在線發(fā)表了題為“Absolute quantification of single-base m⁶A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI”的研究成果。

論文截圖

m⁶A是高等真核生物mRNA內(nèi)部含量最豐富的修飾，大約0.2—0.6%的腺苷中存在m⁶A修飾。m⁶A依賴修飾酶、去修飾酶和結(jié)合蛋白發(fā)揮調(diào)控功能。目前已發(fā)現(xiàn)m⁶A具有調(diào)控mRNA剪接、出核、穩(wěn)定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發(fā)育、配子發(fā)生、細(xì)胞重編程、生物節(jié)律、疾病等多種生理和病理過程的功能調(diào)控。為了更好地研究m⁶A生物功能和臨床病理研究，開發(fā)m⁶A高通量測(cè)序技術(shù)一直是m⁶A領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

盡管目前已經(jīng)開發(fā)了多種m⁶A檢測(cè)和測(cè)序方法，但是現(xiàn)有的技術(shù)仍然存在以下局限性：（1）基于m⁶A抗體的檢測(cè)方法無法獲得其高分辨率的位點(diǎn)信息。（2）基于限制性內(nèi)切酶的檢測(cè)技術(shù)只能檢測(cè)含有ACA 基序的m⁶A。（3）基于三代測(cè)序和機(jī)器學(xué)習(xí)的方法價(jià)格昂貴、檢測(cè)準(zhǔn)確性低等問題，且不能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)m⁶A的絕對(duì)定量。迄今為止，對(duì)m⁶A全轉(zhuǎn)錄組的無偏好檢測(cè)和絕對(duì)定量仍未得到解決。

新開發(fā)的m⁶A檢測(cè)技術(shù)“GLORI”突破了以上技術(shù)局限性，首次實(shí)現(xiàn)了真正意義的高效率、高靈敏度、高特異性、無偏好單堿基m⁶A位點(diǎn)檢測(cè)，并對(duì)m⁶A位點(diǎn)的修飾水平進(jìn)行絕對(duì)定量。GLORI的技術(shù)核心是不依賴于抗體，通過化學(xué)反應(yīng)組合篩選發(fā)現(xiàn)乙二醛和亞硝酸鹽的催化體系，對(duì)未甲基化的腺苷進(jìn)行高效地脫氨從而形成肌苷（A-to-I, > 98%），肌苷在測(cè)序過程中被讀成鳥苷（G），形成A-to-G的轉(zhuǎn)化；而m⁶A則仍被讀成A。GLORI通過檢測(cè)測(cè)序的讀段序列中A所占的比例，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單堿基m⁶A的絕對(duì)定量。因此，GLORI技術(shù)在概念上類似于利用亞硫酸氫鹽定量分析基因組5mC的含量。

圖1. GLORI 的檢測(cè)原理。a. GLORI實(shí)現(xiàn)A-to-I的轉(zhuǎn)化。b. GLORI的化學(xué)反應(yīng)過程。c. GLORI中乙二醛和亞硝酸鹽介導(dǎo)脫氨作用前后(上)和(下)的LC-MS/MS分析。d. GLORI技術(shù)在基因MRPS26上定量檢測(cè)m⁶A位點(diǎn)的例子

隨后，研究團(tuán)隊(duì)在HEK293T轉(zhuǎn)錄組中，鑒定出了176,642個(gè)m⁶A位點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)，隨著測(cè)序深度的增加，可檢測(cè)的m⁶A位點(diǎn)可以進(jìn)一步的增加，該結(jié)果擴(kuò)展了人們對(duì)mRNA上m⁶A存在數(shù)量的認(rèn)識(shí)。此外，GLORI技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)m⁶A的準(zhǔn)確定量：即使修飾水平較低的m⁶A（5%），GLORI也能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)。隨后對(duì)含有不同m⁶A修飾水平的mRNA進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，mRNA上整體m⁶A的修飾水平和RNA的轉(zhuǎn)錄水平及翻譯效率都呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。至此，GLORI首次實(shí)現(xiàn)了全轉(zhuǎn)錄組的m⁶A定量圖譜，也完成了對(duì)基因表達(dá)和翻譯調(diào)控的定量評(píng)估。

圖2. GLORI轉(zhuǎn)錄組內(nèi)定量檢測(cè)m⁶A。a. GLORI在HEK293中檢測(cè)的位點(diǎn)。b. GLORI能夠準(zhǔn)確檢測(cè)spike-in中m⁶A位點(diǎn)的修飾水平。c. GLORI檢測(cè)的m⁶A位點(diǎn)的修飾水平在技術(shù)重復(fù)之間的相關(guān)性。d. HEK293中m⁶A位點(diǎn)修飾水平的整體分布。e. 含有不同m⁶A修飾水平的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。f. 含有不同m⁶A修飾水平的mRNA的翻譯效率比較

此外，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在一些基因的特定區(qū)域中出現(xiàn)了一類聚集分布的m⁶A位點(diǎn)（m⁶A簇）。相比于不具有這類m⁶A簇的基因，這類m⁶A簇的基因顯著降低基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯效率，從而負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)。

圖3. m⁶A簇的發(fā)現(xiàn)與功能。a. SPEN基因的特定區(qū)域有聚集分布的m⁶A簇。b. 參與形成m⁶A簇的m⁶A位點(diǎn)具有顯著高的修飾水平。c. 具有m⁶A簇的mRNA具有顯著低的轉(zhuǎn)錄水平。d. 具有m⁶A簇的mRNA具有顯著低的翻譯效率

該研究進(jìn)一步將GLORI技術(shù)應(yīng)用于熱休克及缺氧的兩種壓力體系和HeLa及MEF兩種細(xì)胞系中觀察m⁶A的動(dòng)態(tài)調(diào)控，并提供了轉(zhuǎn)錄組上m⁶A對(duì)壓力條件應(yīng)激的定量圖譜。研究發(fā)現(xiàn)，在兩種壓力體系下約有4.8—11%m⁶A位點(diǎn)具有動(dòng)態(tài)變化，并且上調(diào)和下調(diào)的m⁶A位點(diǎn)表現(xiàn)出不同的富集模式：在缺氧時(shí)，上調(diào)和下調(diào)的位點(diǎn)分布富集在5′UTR和終止密碼子附近，而熱休克體系中這種富集則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。不同于野生型細(xì)胞中m⁶A對(duì)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用：在熱休克條件下，m⁶A整體修飾水平升高的mRNA的翻譯效率顯著上調(diào)，且這種上調(diào)的調(diào)控作用在具有m⁶A簇的mRNA中更為顯著。該結(jié)果提示了m⁶A在不同環(huán)境下對(duì)基因表達(dá)具有特異性的調(diào)控。

圖4. GLORI檢測(cè)動(dòng)態(tài)變化的m⁶A。a. 缺氧誘導(dǎo)m⁶A位點(diǎn)的mRNA分布圖譜。b. 熱休克誘導(dǎo)m⁶A位點(diǎn)的mRNA分布圖譜。c. 熱休克前后MEF細(xì)胞中上調(diào)m⁶A相關(guān)基因翻譯效率的箱線圖和點(diǎn)圖。d. 熱休克后具有或不具有m⁶A簇的基因的翻譯效率的箱線圖

綜上，該研究展示了GLORI技術(shù)高靈敏度、高特異性的無偏好絕對(duì)定量檢測(cè)m⁶A的特性，突破了目前m⁶A定量測(cè)序技術(shù)的瓶頸?；谄湓跈z測(cè)m⁶A方面的優(yōu)異表現(xiàn)，GLORI將有助于推動(dòng)和解決m⁶A在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和臨床檢測(cè)等多種領(lǐng)域中的功能研究和核心生物學(xué)問題, 有望成為定量m⁶A測(cè)序技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

伊成器和王晶為本研究論文的共同通訊作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后劉聰、博士生孫含笑，北京大學(xué)藥學(xué)院博士后衣云鵬（已出站）、直博生申衛(wèi)國(guó)和北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李楷為論文的共同第一作者。該工作得到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目資助。

來源：北京大學(xué)