日前，科學(xué)家報(bào)告了第三款可用于人類基因組編輯的CRISPR-Cas系統(tǒng)–CRISPR-Cas12b。

CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)先驅(qū)之一、美國(guó)麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)Broad研究所張鋒團(tuán)隊(duì)，麻省理工學(xué)院麥戈文腦研究所及國(guó)立衛(wèi)生研究院的研究人員共同發(fā)文證明，CRISPR-Cas12b可精確切割或編輯人類細(xì)胞基因組，同時(shí)具有高靶特異性和小尺寸，與Cas9系統(tǒng)相比，更適于體內(nèi)應(yīng)用，該研究發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。

CRISPR基因編輯技術(shù)及其相關(guān)應(yīng)用是近年生命科學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點(diǎn)研究方向，基于CRISPR技術(shù)，科學(xué)家可高效、快速、便捷地對(duì)基因進(jìn)行編輯。

目前CRISPR系統(tǒng)中有兩類效應(yīng)蛋白家族–Cas9和Cas12a，已被成功改造用于人類細(xì)胞的基因組編輯，然而事實(shí)上，還有一個(gè)極富潛力的成員，就是Cas12b。Cas12b蛋白通常比Cas9和Cas12a更小，更容易通過(guò)病毒載體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間遞送，但Cas12b具有嗜高溫特性，作為DNA裂解酶的最佳活性需要高達(dá)48℃，因而在人類細(xì)胞中的應(yīng)用受限。

Cas9、Cas12a、Cas12b三種核酸酶的位點(diǎn)圖和蛋白結(jié)構(gòu)（圖片來(lái)源：Nature Communications）

Cas12b來(lái)自生活在溫泉、火山和深海熱液噴口等熱環(huán)境中的高溫細(xì)菌，張鋒表示，“我們希望從自然中發(fā)現(xiàn)靈感，研制出一種能在較低溫度下工作的Cas12b，我們掃描了數(shù)千個(gè)細(xì)菌基因序列，尋找能在哺乳動(dòng)物環(huán)境較低溫度下茁壯成長(zhǎng)的細(xì)菌?！?/p>

“我們測(cè)量了兩個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的插入缺失活性，共有176個(gè)BhCas12b單突變體，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)突變的活性增加，包括K846R和S893R，它們作為雙突變體表現(xiàn)出增強(qiáng)效應(yīng)，”作者寫道?！白罱K確定的BhCas12b v4突變體，其中含有K846R/S893R/E837G，在多個(gè)靶標(biāo)上表現(xiàn)出最高活性?！?/p>

用純化的Cas12b蛋白體外重組Cas12b系統(tǒng)，通過(guò)RNA-Seq鑒定合成crRNA和tracrRNA。（圖片來(lái)源：Nature Communications）

為了解決這個(gè)問題，研究者對(duì)Cas12b進(jìn)行了工程改造，根據(jù)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的線索，研究人員通過(guò)4個(gè)點(diǎn)突變，得到了重新設(shè)計(jì)的新Cas12b，讓酶的活性位點(diǎn)更容易和DNA靶序列接近。

通過(guò)對(duì)Cas12b的研究，研究人員發(fā)現(xiàn)BhCas12b可在人體體溫37℃時(shí)保持核酸酶活性，但原始結(jié)構(gòu)的野生型BhCas12b會(huì)優(yōu)先切斷非靶DNA鏈，且溫度越低、錯(cuò)誤越多。為解決這一問題，研究人員通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)Cas12b進(jìn)行了改造，通過(guò)4個(gè)點(diǎn)位突變，讓酶的活性點(diǎn)位更容易和DNA靶序列接近，增強(qiáng)了其在37℃下的活性。

在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)改造后的BhCas12b針對(duì)多個(gè)基因的多個(gè)靶序列進(jìn)行編輯效率檢測(cè)，研究證實(shí)BhCas12b具有更高的特異性，其編輯效率與Cas9、Cas12a相當(dāng)，甚至更高。在人類細(xì)胞測(cè)試中，改造后的BhCas12b在37°C時(shí)表現(xiàn)出增加的雙鏈DNA切割活性，并且在不同的Cas核酸酶之間選擇的9個(gè)具有可比活性的靶位點(diǎn)中，BhCas12b沒有發(fā)現(xiàn)任何的靶外位點(diǎn)，這極大地降低了CRISPR技術(shù)最大的隱患之一–脫靶效應(yīng)。

BhCas12b具有高度特異性（圖片來(lái)源：Nature Communications）

作為第三個(gè)可用于人類基因組編輯的CRISPR-Cas系統(tǒng)，Cas12b未來(lái)可期。“這進(jìn)一步證明，還有許多有用的CRISPR系統(tǒng)有待發(fā)現(xiàn)，”該研究的第一作者、人類前沿科學(xué)項(xiàng)目研究員Jonathan Strecker說(shuō)道。

事實(shí)上，自從Cas12b酶家族在2015年首次被描述并被證明是RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)核酸酶以來(lái)，有幾個(gè)小組一直在探索這個(gè)酶家族。2017年，加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)研究小組報(bào)告稱，酸桿菌Cas12b可以在體外介導(dǎo)DNA的非特異性側(cè)枝分裂。

另外，值得一提的是，2018年11月27日，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所李偉團(tuán)隊(duì)在《Cell Discovery》發(fā)文，表示已鑒定出若干能在人體生理溫度工作的Cas12b/C2c1酶，且經(jīng)過(guò)系統(tǒng)改造，有兩種Cas12b酶被成功開發(fā)成為哺乳動(dòng)物基因組編輯工具，能夠編輯人類細(xì)胞基因組并應(yīng)用于制備動(dòng)物疾病模型。

文章表示，Cas12b酶有若干優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)：Cas12b比應(yīng)用最為廣泛的SpCas9和Cas12a更小，因此更容易用于需要在體遞送的基因治療；Cas12b能夠在寬廣的溫度范圍和pH范圍保持高的酶活性，有望適用于具有不同生理溫度的多個(gè)物種。同時(shí)與SpCas9相比，Cas12b核糖核酸酶（RNP）在人血漿中更穩(wěn)定；Cas12b很難耐受向?qū)NA與靶DNA之間的堿基錯(cuò)配，因此比SpCas9和Cas12a的脫靶效應(yīng)更小，這意味著它在進(jìn)行基因組編輯時(shí)更加安全。

針對(duì)這項(xiàng)新技術(shù)，該研究團(tuán)隊(duì)已于一年前提交了專利申請(qǐng)，并正在開發(fā)這項(xiàng)技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用。

來(lái)源：醫(yī)谷

參考文獻(xiàn)

《Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing》

《Scientists engineer new CRISPR platform for DNA targeting》