本月上旬的circRNA研究文獻(xiàn)共計15篇，涉及脂肪肝、肝炎、高血壓、狼瘡性腎炎、妊娠糖尿病和卵巢子宮癌等12個疾病方向，這些研究為circRNA在各疾病領(lǐng)域的作用機(jī)制提供了很好的前期研究基礎(chǔ)。在circRNA的技術(shù)應(yīng)用方面，來自德國吉森大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化所的研究人員構(gòu)建了人工circRNA分子，可以吸附丙肝細(xì)胞中的miR-122，進(jìn)而阻止HCV病毒蛋白形成，緩解丙型肝炎，下面我們一起了解下該項研究的具體內(nèi)容。

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人造circRNA分子阻止丙型肝炎病毒進(jìn)程

論文題目：Functional sequestration of microRNA-122 from Hepatitis C Virus by circular RNA sponges.

雜志：RNA biology
影響因子：3.9分

通訊作者單位：德國吉森大學(xué)

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研究者將丙型肝炎病毒（HCV）引起的肝炎作為研究對象，HCV是一種單鏈RNA病毒，缺乏5’帽子結(jié)構(gòu)，可通過高度結(jié)構(gòu)化的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES啟動蛋白翻譯，HCV是肝臟細(xì)胞特異性病毒，已有研究表明HCV的這種嗜肝細(xì)胞特性主要依賴人體內(nèi)的miR-122分子，HCV病毒基因組5’端存在兩個miR-122的結(jié)合位點(diǎn)，miR-122可保護(hù)病毒RNA免受Xrn-1的核酸外切降解，增強(qiáng)病毒復(fù)制和病毒蛋白的翻譯，從而促進(jìn)HCV的繁殖。因此miR-122已成為丙型肝炎藥物治療的主要靶標(biāo)之一，基于miR-122的鎖核苷酸LNA藥物已進(jìn)入二期臨床試驗。

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人工circRNA體外設(shè)計合成

由于circRNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)，不存在5’和3’的游離末端，在細(xì)胞中的穩(wěn)定性比線性分子更強(qiáng)，因此研究者考慮將包含miRNA-122結(jié)合位點(diǎn)（串聯(lián)重復(fù)）的序列體外人工合成circRNA分子。

圖注：人工構(gòu)建circRNA序列及T4連接酶成環(huán)示意圖（A,B），Nothern blot驗證體外合成的circRNA分子。人工合成的circRNA即存在細(xì)胞質(zhì)也存在于細(xì)胞核中（圖E）。

該人工設(shè)計的circRNA組成序列，主要包含4個部分，含有miR-122結(jié)合位點(diǎn)的8聚體（圖A藍(lán)色區(qū)段），隨機(jī)改組的序列（圖A灰色區(qū)段），紅色區(qū)段的互補(bǔ)配對莖部序列（利于序列成環(huán)），序列前端的T7轉(zhuǎn)錄啟動子序列和酶切位點(diǎn)。將設(shè)計合成好的DNA序列克隆到pCR2.1載體，轉(zhuǎn)錄后得到的RNA序列最后用T4連接酶進(jìn)行連接即可得到合成的circRNA。

CircRNA不僅可以吸附miRNA，還可以吸附結(jié)合蛋白，設(shè)計結(jié)合蛋白的circRNA分子或許更容易實現(xiàn)，可以推測的是人工合成的circRNA可通過隔離miRNA分子抑制病毒的復(fù)制，是否也可以隔離有利于病毒擴(kuò)增的蛋白，進(jìn)一步抑制病毒進(jìn)程將是特別有意思研究方向，也為circRNA應(yīng)用與疾病治療打開了一扇新的大門。

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人工circRNA可抑制HCV蛋白翻譯

研究者使用非感染性HCV /螢光素酶報道系統(tǒng)，其中HCV多蛋白開放閱讀框（ORF）的主要部分被螢光素酶ORF替代，保留HCV核心蛋白編碼序列的天然起始密碼子和前33nt，維持內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)染HuH-7.5細(xì)胞后檢測熒光值判斷人工circRNA抑制蛋白翻譯的作用。

圖注：熒光素酶報告實驗顯示人工circRNA可一直HCV病毒的翻譯。

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人工circRNA的作用與優(yōu)勢

????最后研究者也闡述了人工circRNA的其他可能應(yīng)用及優(yōu)勢，為circRNA進(jìn)入疾病治療的研究提供了參考方向。

1）外顯子來源的circRNA定位在細(xì)胞質(zhì)，人工circRNA可進(jìn)入細(xì)胞核，可作為染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和RNA前體剪切的分子工具；

2）目前開發(fā)的miRNA誘餌LNA鎖核苷酸藥物，由于LNA修飾的特性，在人體聚集不可降解，存在肝臟毒性效益，人工circRNA模擬自然circRNA分子存在代謝途徑可避免此效益；

3）人工合成circRNA可以通過多種方法實現(xiàn)，除T4連接酶體外連接，還可以通過tRNA的剪接機(jī)制生成或構(gòu)建通用過表達(dá)質(zhì)粒（如吉賽pCD-ciR系列circRNA過表達(dá)載體）；

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文獻(xiàn)統(tǒng)計表

參考文獻(xiàn)見上表。

文 | circRNA 吉賽生物

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