氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，而其變化也與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。盡管目前利用堿基編輯等技術(shù)^1,2可以在基因組中實(shí)現(xiàn)堿基替換進(jìn)而改變密碼子，產(chǎn)生內(nèi)源氨基酸的突變，但在全蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)對特定氨基酸殘基進(jìn)行系統(tǒng)性的功能分析仍然面臨挑戰(zhàn)。

2023年11月22日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魏文勝教授團(tuán)隊(duì)在Molecular Cell雜志在線發(fā)表了題為“Unbiased interrogation offunctional lysine residues in human proteome”的研究論文。該研究采用腺嘌呤堿基編輯工具，建立了一種在全蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)篩選功能性氨基酸位點(diǎn)的策略，并通過細(xì)胞適應(yīng)性篩選，獲得了蛋白質(zhì)組功能性賴氨酸位點(diǎn)的圖譜。

在人類蛋白質(zhì)組眾多的氨基酸殘基中，研究者首先關(guān)注了賴氨酸。賴氨酸殘基攜帶正電荷，在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、與其他分子的相互作用等方面發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也是多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾（如泛素化、乙?；?、甲基化）的重要受體氨基酸殘基。賴氨酸的密碼子為5’-AAA或5’-AAG，利用腺嘌呤編輯器（Adenine base editors, ABEs）對其密碼子進(jìn)行編輯，可以實(shí)現(xiàn)賴氨酸的定向突變（圖1）。

圖1. 賴氨酸定向突變示意圖

該研究利用ABEmax系統(tǒng)在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系RPE1中構(gòu)建了靶向賴氨酸位點(diǎn)的sgRNA文庫³，包含約30萬條sgRNA，覆蓋了85%的編碼基因、85%的蛋白質(zhì)以及35%的賴氨酸密碼子。為提高篩選質(zhì)量并大幅縮減建庫所需細(xì)胞數(shù)量，研究者結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期建立的iBAR策略進(jìn)行了細(xì)胞適應(yīng)性篩選⁴，最終獲得了1572個(gè)促進(jìn)或抑制細(xì)胞存活的賴氨酸突變位點(diǎn)。

基于課題組前期在RPE1細(xì)胞系中進(jìn)行的基因敲除篩選結(jié)果⁵，研究者將賴氨酸位點(diǎn)的得分映射到其所在基因上，形成了基因（蛋白）-賴氨酸位點(diǎn)的功能性圖譜（圖2）。值得注意的是，大量賴氨酸位點(diǎn)的突變導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)出與相應(yīng)基因敲除不同的細(xì)胞適應(yīng)性表型。在這些突變位點(diǎn)中，有805個(gè)位點(diǎn)突變后會抑制細(xì)胞存活，然而對應(yīng)的基因敲除卻未對細(xì)胞存活產(chǎn)生影響或促進(jìn)細(xì)胞存活。通過對國際癌癥基因組聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫（ICGC）的數(shù)據(jù)挖掘，研究者鑒定了若干具有臨床意義的賴氨酸突變位點(diǎn)，包括已有報(bào)道的TP53-K120、BRAF-K601、PTEN-K13等位點(diǎn)，然而大多數(shù)賴氨酸位點(diǎn)的功能仍不為人知。

圖2. 兩種篩選結(jié)果對比圖

在正向富集的賴氨酸位點(diǎn)中，研究者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)以CUL3為核心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。CUL3是泛素化復(fù)合物（cullin-RING ligases，CRLs）中的重要成員。該研究篩選到位于其骨架蛋白、接頭蛋白、激活蛋白、底物蛋白多個(gè)賴氨酸位點(diǎn)（圖3）。通過親和純化-質(zhì)譜等方法，研究者發(fā)現(xiàn)CUL3-K638E能夠顯著削弱CUL3和去nedd化復(fù)合物（COP9 signalosome，CSN）的結(jié)合，導(dǎo)致其持續(xù)處于nedd化狀態(tài)而最終降低了穩(wěn)定性。

圖3. CUL3 CRLs復(fù)合物

最終，研究者將關(guān)注點(diǎn)聚焦在CUL3的接頭蛋白KCTD10的K171位點(diǎn)上，該位點(diǎn)在一名乳腺癌患者體內(nèi)檢測到了突變（K171E）。通過一系列實(shí)驗(yàn)，研究者證實(shí)KCTD10-K171能夠發(fā)生乙酰化修飾，并通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白TPX2和INCENP的蛋白穩(wěn)態(tài)來控制下游信號通路，確保細(xì)胞周期正常進(jìn)行。KCTD10-K171的突變可能導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白無法正常降解，從而引起細(xì)胞過度增殖。該位點(diǎn)可能成為潛在的癌癥標(biāo)志突變，有助于癌癥的診斷和預(yù)后，并為新藥研發(fā)提供指導(dǎo)。

總的來說，本研究利用堿基編輯技術(shù)成功建立了高通量的氨基酸精度功能性篩選方法，為系統(tǒng)性研究蛋白質(zhì)功能和調(diào)控機(jī)制提供了新的有效手段。同時(shí)，所得到的氨基酸精度的蛋白質(zhì)功能性大數(shù)據(jù)為更深入地理解蛋白質(zhì)調(diào)控機(jī)制，尤其是翻譯后修飾機(jī)制，提供了有力的依據(jù)（圖4）。

圖4. 總結(jié)圖

魏文勝課題組博士后寶穎、博士研究生潘倩和已畢業(yè)的許萍博士和劉志恒博士為論文的共同第一作者，魏文勝和副研究員周卓（現(xiàn)為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院/蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所研究員）為論文的共同通訊作者。該研究獲得了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、北京市科委生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新推進(jìn)項(xiàng)目、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京昌平實(shí)驗(yàn)室、重大疾病共性機(jī)制研究全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等的支持。

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來源：北京大學(xué)