轉(zhuǎn)錄因子（TFs）作為基因表達(dá)的“指揮家”，通過(guò)與雙鏈DNA（dsDNA）上的特定序列-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）結(jié)合，來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。傳統(tǒng)TF與dsDNA的結(jié)合序列的確定實(shí)驗(yàn)是由DNA酶切的“足跡”（Foot-printing）法獲得。借助“足跡”法，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了很多不同DNA結(jié)合序列，即Motifs。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，成千上萬(wàn)個(gè)TFs已被確定出來(lái)。如何高效、準(zhǔn)確地識(shí)別和刻畫(huà)TF的TFBS，特別是理解這些不同的TFs是如何快速靶向其特異結(jié)合位點(diǎn)，一直是分子生物學(xué)家探索的難題之一?？茖W(xué)家相繼開(kāi)發(fā)了ChIP-seq方法及其多種現(xiàn)代版本、SELEX及其HT-SELEX（high-throughput systematic evolution of ligands by exponential enrichment）方法和PBM（protein binding microarray），以及MITOMI等單分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)探索該問(wèn)題。在計(jì)算方面，通常采用位置權(quán)重矩陣（PWM）來(lái)描述和計(jì)算TFBS Motif的特征，但PWM方法假設(shè)堿基間相互獨(dú)立，得到Motif（通常長(zhǎng)度在810bp）受實(shí)驗(yàn)方法和序列比對(duì)的影響并不一致，且該方法只能從序列的角度總結(jié)TF的特異性結(jié)合規(guī)律，無(wú)法從物理機(jī)制角度來(lái)解釋TF如何高效識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)位點(diǎn)。近年來(lái)的研究還表明，TF在基因組中的搜索過(guò)程可能受到TFBS周圍重復(fù)簡(jiǎn)并序列的引導(dǎo)?；蚪M中普遍存在的短串聯(lián)重復(fù)序列（STRs；26個(gè)堿基對(duì)的串聯(lián)重復(fù)）在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。然而，這些DNA結(jié)合方式的具體機(jī)制細(xì)節(jié)仍不清晰，也很難用傳統(tǒng)的Motif概念來(lái)解釋。

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2025年3月26日，生命科學(xué)學(xué)院/生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）蘇曉東課題組在Advanced Science上在線發(fā)表了題為“DNA–Protein Binding is Dominated by Short Anchoring Elements”的研究論文。該研究揭示了TF與DNA結(jié)合時(shí)短序列（3—4個(gè)堿基對(duì)）起到主導(dǎo)作用，并將該短序列命名為錨定元件（Anchoring Elements, AEs）。論文還指出AE的密度（AED）能夠吸引相應(yīng)TF并促進(jìn)其進(jìn)一步搜索并結(jié)合到其TFBS上。

研究團(tuán)隊(duì)此前已經(jīng)基于二代深度測(cè)序技術(shù)（NGS）開(kāi)發(fā)了一種全面測(cè)量熱平衡態(tài)下TF與所有可能的DNA序列的結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)方法KaScape（Chen, H., Xu, Y., Jin, J. et al. Sci Rep 13, 16595 (2023)）。本研究進(jìn)一步以擬南芥WRKY1和人類PU.1等轉(zhuǎn)錄因子為模型，利用KaScape方法系統(tǒng)分析了TF與DNA的結(jié)合特性。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合能力較強(qiáng)的序列中均含有一段共有的3—4個(gè)堿基對(duì)的短序列且只要含有該短序列，其結(jié)合能力均較強(qiáng)，這說(shuō)明該短序列在TF與DNA的結(jié)合中起決定性作用。由此，本研究將該短序列命名為AE。擬南芥WRKY1的AE為GAC/GTC（GAC和GTC為反向互補(bǔ)序列），而人類PU.1的AEs為GGAA/TTCC（GGAA和TTCC為反向互補(bǔ)序列）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AEs的作用，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了AEEscape算法。該算法能夠計(jì)算隨機(jī)序列區(qū)域每個(gè)位置的k-mer結(jié)合能量，將PWM從1-mer拓展到了k-mer。該算法發(fā)現(xiàn)，以WRKY為例，當(dāng)短序列長(zhǎng)度為2時(shí)，各個(gè)位置的2-mer結(jié)合能全景圖不一致；當(dāng)短序列長(zhǎng)度為3時(shí)，各個(gè)位置的結(jié)合能全景圖類似，GAC或者GTC在隨機(jī)區(qū)域的各個(gè)位置的結(jié)合能力均最強(qiáng)；當(dāng)短序列長(zhǎng)度為4時(shí)，隨機(jī)區(qū)域各個(gè)位置的結(jié)合能力最強(qiáng)的那些4-mer序列均含有GAC或者GTC。以上分析說(shuō)明了AE是TF與DNA結(jié)合時(shí)的最核心、最基本的元件。本研究隨后使用AEEscape算法得到的k-mer能量全景圖預(yù)測(cè)了基因組中TFBS區(qū)域的能量譜，發(fā)現(xiàn)在TFBS區(qū)域存在“能量漏斗”現(xiàn)象，該現(xiàn)象的存在說(shuō)明TFBS周圍的序列能夠幫助TF快速搜索到其目標(biāo)位點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該現(xiàn)象與TFBS附近AE的密度有關(guān)。

圖1 WRKY1 N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（WRKY1N）與DNA的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（6j4e.pdb）。WRKY1N覆蓋的區(qū)域（Foot-printing or Motif region）用藍(lán)色雙箭頭標(biāo)出，結(jié)合時(shí)起主導(dǎo)作用的短DNA序列Anchoring Element（AE）對(duì)應(yīng)的堿基由藍(lán)框標(biāo)注。兩條DNA鏈分別標(biāo)注為Watson strand和Crick strand。對(duì)WRKY1N來(lái)說(shuō)，其主要與Crick strand上的GTC（AE）相互作用

為了探究AE的廣泛存在性，本研究還進(jìn)一步分析了公共數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)TF的PBM數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了非常有趣的相似現(xiàn)象，驗(yàn)證了AE的廣泛存在性。本研究中鑒定的AEs與DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究中描述的“核心序列”很好對(duì)應(yīng)（圖1），復(fù)合物結(jié)構(gòu)可以解釋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及相互作用的細(xì)節(jié)，但是目前的計(jì)算方法還無(wú)法很好地得到結(jié)合能，因而不能確切鑒定到最小相互作用單元必要的核心序列。這些核心序列代表了參與靜電、氫鍵、范德瓦爾斯等相互作用的關(guān)鍵堿基。這些相互作用對(duì)DNA與TF結(jié)合的熱力學(xué)穩(wěn)定性和“特異性”至關(guān)重要，只要這些“核心”堿基存在于實(shí)驗(yàn)的序列中，KaScape方法即可以將其拉下來(lái)（pull-down），因此，與本研究中的AEs類似，這些“核心序列”較短，一般遠(yuǎn)小于Motif長(zhǎng)度。綜上所述，AE可以被視為負(fù)責(zé)TF結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)（序列）單元，也表明構(gòu)成AE的短k-mer序列與TF相互作用時(shí)，應(yīng)被視為一個(gè)整體，而不是獨(dú)立的堿基。由于僅從復(fù)合物結(jié)構(gòu)無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算出結(jié)合能，基于結(jié)構(gòu)來(lái)定義“核心序列”具有一定的主觀性和隨意性，而KaScape實(shí)驗(yàn)的pull-down富集結(jié)果客觀地得到了這些“核心序列”在DNA結(jié)合機(jī)制中起關(guān)鍵作用的客觀而重要的結(jié)論。

這項(xiàng)研究不僅為TF與DNA結(jié)合的分子機(jī)制提供了全新的視角，還為基因表達(dá)的調(diào)控研究開(kāi)辟了新的方向，為未來(lái)設(shè)計(jì)基因調(diào)控工具和開(kāi)發(fā)基因治療策略提供了重要的理論基礎(chǔ)。陳紅博士為論文的第一作者，蘇曉東為該論文的通訊作者。研究團(tuán)隊(duì)未來(lái)將進(jìn)一步探索AEs在更復(fù)雜生物系統(tǒng)中的作用，例如在染色質(zhì)環(huán)境下TF與核小體DNA的相互作用，以及多TF協(xié)同調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制。這些研究將有助于更深入地理解基因調(diào)控的復(fù)雜性，并為生物信息學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和合成生物學(xué)提供新的工具和方法。

來(lái)源：北京大學(xué)