問(wèn)題在于miRNA分子由很短的核苷酸序列組成，它們對(duì)探針設(shè)計(jì)和標(biāo)記選擇提出了挑戰(zhàn)。不同miRNA在退火反應(yīng)中的解鏈溫度可能存在很大的差異，它們的濃度可能是按數(shù)量級(jí)變化的，并且它們很難與miRNA前體和轉(zhuǎn)錄后修飾產(chǎn)生的變體區(qū)分開(kāi)。因此，鑒定和定量miRNA分子本質(zhì)上具有挑戰(zhàn)性。

問(wèn)題的另一個(gè)方面是，miRNA存在于不同的組織、分離的細(xì)胞和細(xì)胞外囊泡中，并且在生物流體中游離時(shí)會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合。不同的miRNA樣本類型需要不同類型的提取技術(shù)，即使是同種類型的提取技術(shù)也可能存在微小但最終意義重大的變化，導(dǎo)致不同的結(jié)果。其他變化的來(lái)源還包括miRNA測(cè)量和數(shù)據(jù)解釋。

為了克服這些可變性，從而找到更多需要的共同點(diǎn)，研究人員正在努力標(biāo)準(zhǔn)化miRNA的分析流程方案，協(xié)調(diào)來(lái)自不同研究團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果，并開(kāi)發(fā)能夠提供可靠診斷和預(yù)后結(jié)果的應(yīng)用程序。隨著此項(xiàng)工作的推進(jìn)，逐步實(shí)現(xiàn)了miRNA作為生物標(biāo)志物的潛力，這些標(biāo)志物已在最近的許多研究中得到證實(shí)。

MicroRNA作為生物標(biāo)志物

除了回顧，還可以查閱目前關(guān)于miRNA生物標(biāo)志物研究的最新報(bào)道。例如，在過(guò)去一年中，發(fā)表了針對(duì)以下情況的新發(fā)現(xiàn)：

• 支氣管肺發(fā)育不良，可導(dǎo)致低出生體重嬰兒死亡或長(zhǎng)期疾?。ò⒗婉R大學(xué)伯明翰分校，JCI Insight）。
• 心房顫動(dòng)是一種心律失常，常因缺乏癥狀而被忽視（東京醫(yī)科大學(xué)，Circulation）。
• 盧伽雷氏?。↙ou Gehrig病），或肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS），一種破壞神經(jīng)細(xì)胞并導(dǎo)致永久性殘疾的神經(jīng)退行性疾?。ㄒ陨刑乩S夫大學(xué)，The Journal of Neuroscience）。
• 與睡眠剝奪有關(guān)的認(rèn)知表現(xiàn)缺陷。（賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院，SLEEP 2018）。
• 阿爾茨海默病（印第安納大學(xué)，Nature Scientific Reports）。
• 膿毒癥是一種極端且危及生命的感染反應(yīng)，可引發(fā)全身炎癥（哥倫比亞大學(xué)歐文醫(yī)學(xué)中心，Nature）。
• 血液興奮劑，輸注自體紅細(xì)胞以增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)（杜克大學(xué)，British Journal of Haematology）。

MicroRNA分析要略

當(dāng)miRNA表達(dá)出錯(cuò)時(shí)，可能引起包括基因表達(dá)的失調(diào)，這反過(guò)來(lái)會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。幸運(yùn)的是，miRNA在各種樣本類型中（液體活檢樣本以及新鮮和固定的組織樣本）相對(duì)穩(wěn)定，這提高了miRNA能夠被充分定量以便識(shí)別疾病特征的可能性。

• 純化技術(shù)（例如凝膠電泳、免疫沉淀和激光捕獲顯微切割）。
• 質(zhì)量控制檢查（例如測(cè)量spike-in寡核苷酸濃度或管家RNA表達(dá)、分光光度分析、或自動(dòng)毛細(xì)管電泳）。
• MicroRNA測(cè)量技術(shù)（例如基于qRT-PCR的方法、基于雜交的方法和RNA測(cè)序）。

RNA分析工作流程

Dr. Angeloni：對(duì)于miRNA的原位雜交檢測(cè)，正確的樣品制備和具有良好信噪比和特異性的探針是至關(guān)重要的。對(duì)于PCR和測(cè)序技術(shù)，第一個(gè)限制因素是從不同樣品中分離出足夠量的高質(zhì)量RNA。對(duì)于其中一些分子技術(shù)，下一個(gè)關(guān)鍵因素是要有有效的擴(kuò)增接頭或良好的莖環(huán)引物，以便準(zhǔn)確地將miRNA轉(zhuǎn)化為可用于分析的cDNA。

Dr. Angeloni：由于越來(lái)越多的miRNA標(biāo)志物與不同疾病相關(guān)并在診斷中變得重要，因此從小樣本中檢測(cè)出更多miRNA標(biāo)志物的需求正在增加。對(duì)于一些基于PCR的技術(shù)來(lái)說(shuō)，很難區(qū)分可能因單個(gè)核苷酸而不同的miRNAs。此外，從各種體液(尿液、血清和其他體液)中分離出的高質(zhì)量RNA的數(shù)量可能過(guò)低，無(wú)法準(zhǔn)確鑒定低濃度的miRNA。當(dāng)重要的miRNA標(biāo)志物因單個(gè)核苷酸而異時(shí)，這些因素可能對(duì)某些診斷應(yīng)用造成嚴(yán)重限制。

Dr. Angeloni：隨著miRNA表達(dá)的變化或序列變異導(dǎo)致不同疾病的發(fā)展，這為新的治療靶點(diǎn)打開(kāi)了大門。因此，miRNAs作為治療藥物的使用已經(jīng)得到了一些成功的測(cè)試。另一個(gè)令人興奮的方法是miRNA靶向藥物的開(kāi)發(fā)。一些公司正在開(kāi)發(fā)針對(duì)心血管疾病、一些傳染病、代謝性疾病、癌癥和一些其他非癌癥疾病的miRNA藥物。由于miRNA涉及廣泛的人類疾病，開(kāi)發(fā)新的有效miRNA靶向治療策略具有廣闊的前景。

循環(huán)MicroRNAs作為生物標(biāo)志物

這種關(guān)注早在2012年的評(píng)論中就提到過(guò)，現(xiàn)在依然適用。為了解決這一問(wèn)題，Tewari博士最近致力于促進(jìn)液體活檢研究的可重復(fù)性，通過(guò)RNA測(cè)序來(lái)定量miRNA。

研究設(shè)計(jì)概述

“我們意識(shí)到，”主要研究作者M(jìn)aria D. Giraldez博士說(shuō)?！?strong>不僅不同的方法會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果，而且在給定的方案中，任何微小的變化都會(huì)帶來(lái)重要的變異程度。為了比較實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果，關(guān)鍵是使用一種通用的、高度標(biāo)準(zhǔn)化的流程方案。”

根據(jù)該研究，不同的測(cè)序方法對(duì)單個(gè)標(biāo)志物的豐度估計(jì)不同，而且往往不準(zhǔn)確。該研究還表明，使用聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的方法可以改善這些估算。最后，正如密歇根大學(xué)的新聞稿所指出的，當(dāng)使用RNA測(cè)序來(lái)比較不同樣本之間單個(gè)miRNA的相對(duì)量時(shí)，所有方法都能得到準(zhǔn)確且可重復(fù)的估計(jì)值。

來(lái)源：銳博生物