前面給大家分享了一篇應(yīng)用GEO/TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘CRC早期診斷和良好預(yù)后的循環(huán)外泌體miRNA生物標(biāo)志物的文章《GEO/TCGA數(shù)據(jù)挖掘：外泌體miRNA輕松發(fā)4.5分Biomarker Paper》。今天給大家分享一篇利用外泌體miRNA測(cè)序技術(shù)評(píng)估腫瘤來源外泌體miRNA作為早期非小細(xì)胞肺癌的潛在診斷生物標(biāo)志物的文章。該研究在Discovery階段通過外泌體miRNA高通量測(cè)序確定候選靶標(biāo)，隨后在Validation set和Symptomatic set通過qRT-PCR和ROC分析評(píng)估了候選外泌體miRNA或外泌體miRNA panel作為biomarker的診斷效用。
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圖1. Biomarker發(fā)現(xiàn)策略示意圖

??研究背景??

肺癌仍然是中美兩國(guó)男性和女性癌癥死亡的主要原因。晚期診斷是改善肺癌預(yù)后的主要障礙。miRNAs在肺癌的診斷和預(yù)后中得到了廣泛的研究。但利用外周血確定早期NSCLC診斷中腺癌和SCC特異性miRNA表達(dá)譜的研究卻很少。另外，體液外泌體miRNAs的鑒定證明了其在NSCLC的臨床診斷和預(yù)后方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。然而，血漿中腫瘤細(xì)胞來源的外泌體miRNAs能否提示早期NSCLC診斷尚不清楚。本研究的目的是鑒定腫瘤來源的外泌體生物標(biāo)志物，能夠作為一種無創(chuàng)方法在早期診斷中區(qū)分腺癌和SCC，從而在早期階段提高NSCLC診斷的特異性和敏感性。

??研究策略??

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圖2. 外泌體miRNA生物標(biāo)志物研究思路

??研究結(jié)果??

1. 外泌體抽提與鑒定
提取健康對(duì)照、AC和SCC患者總的和腫瘤來源外泌體，并通過Western blot和紅外成像系統(tǒng)對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定和分析。
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圖3. 外泌體的鑒定
2. 鑒定健康志愿者與腺癌和SCC患者腫瘤來源外泌體中與血漿總外泌體相關(guān)的miRNAs (Testing set)
研究人員采用miRNA-seq鑒定了能夠區(qū)分健康組與腺癌組和SCC組的miRNAs。并通過進(jìn)一步的分析，選取了腺癌患者中20個(gè)上調(diào)和31個(gè)下調(diào)的miRNAs，SCC患者中15個(gè)上調(diào)和20個(gè)下調(diào)的miRNAs，進(jìn)行下一階段實(shí)驗(yàn)。
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圖4. 通過miRNA-seq數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析鑒定腺癌（AC）和SCC特異性miRNAs
3. 定量PCR驗(yàn)證miRNA-seq數(shù)據(jù)
基于qPCR的方法對(duì)總外泌體和腫瘤來源外泌體（TME）進(jìn)行評(píng)估，鑒定了27個(gè)最顯著的腺癌和SCC特異性miRNAs。發(fā)現(xiàn)與健康組相比，腺癌患者中有11個(gè)miRNAs顯著高表達(dá)，13個(gè)miRNAs表達(dá)水平較低；SCC患者中有6個(gè)miRNAs顯著高表達(dá)，8個(gè)miRNAs表達(dá)水平較低。隨后，選取四個(gè)先前已報(bào)道為NSCLC生物標(biāo)志物并在腺癌和SCC腫瘤來源的外泌體樣品中表達(dá)的miRNAs（let-7b-5p、let-7e-5p、miR-24-3p和miR-486-5p）進(jìn)行驗(yàn)證。qPCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了miRNA-seq表達(dá)譜的可靠性。并且發(fā)現(xiàn)miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p是腺癌特異性，miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b是SCC特異性。
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圖5. qPCR檢測(cè)所選取miRNAs的表達(dá)水平
4. 循環(huán)血漿和腫瘤來源外泌體之間差異miRNA表達(dá)（Validation set）
研究發(fā)現(xiàn)miRNA在超離心后沉積物和外泌體缺失的血漿上清液之間存在明顯的表達(dá)差異。與外泌體缺失的血漿相比，let-7b-5p和miR-486-5p（可區(qū)分NSCLC患者和健康個(gè)體）在外泌體中的表達(dá)豐富。腺癌特異性miR-181b-5p和SCC特異性miR-320b也富集在外泌體中。另外，發(fā)現(xiàn)let-7b-5p、miR-23a-3p和let-7e-5p在組織和循環(huán)外泌體之間密切相關(guān)。
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圖6. 腫瘤來源外泌體miRNA和循環(huán)血漿miRNA相關(guān)性
5. 外泌體miRNA panels作為診斷生物標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確性，用于檢測(cè)早期腺癌和SCC患者（Symptomatic set）
為了評(píng)估m(xù)iRNA-seq譜數(shù)據(jù)對(duì)NSCLC的早期診斷價(jià)值，選擇let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p和miR-486-5p，并使用qPCR測(cè)量了60個(gè)受試者標(biāo)準(zhǔn)化的Ct值，鑒定出43個(gè)NSCLC患者。通過測(cè)量miR-181b-5p和miR-361b-5p以及miR-10b-5p和miR-320b的組合Ct值，進(jìn)一步鑒定出43名NSCLC患者中分別有31名腺癌患者和11名SCC患者。
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圖7. AC和SCC特異性腫瘤來源外泌體miRNA的早期診斷準(zhǔn)確性評(píng)估策略
此外，用于NSCLC診斷的4個(gè)miRNAs在區(qū)分NSCLC患者和非NSCLC患者中的AUC值為0.899，靈敏度為80.25％，特異性為92.31％。用于腺癌診斷的兩個(gè)miRNAs（miR-181-5p和miR-361-5p）在區(qū)分腺癌患者和NSCLC患者的AUC值為0.936，靈敏度為80.65％，特異性為91.67％。用于SCC診斷的兩個(gè)miRNAs（miR-320b和miR-10b-5p）在區(qū)分SCC患者和NSCLC患者的AUC值為0.911，靈敏度為83.33％，特異性為90.32％。3個(gè)miRNA panels可作為NSCLC的主要診斷生物標(biāo)志物。通過將腺癌或SCC特異性miRNAs納入診斷，可以通過進(jìn)一步的病理診斷來改善預(yù)后。
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圖8. 外泌體miRNA診斷價(jià)值
參考文獻(xiàn)：Jin X, Chen Y, Chen H, et al. Evaluation of Tumor-Derived Exosomal miRNA as Potential Diagnostic Biomarkers for Early-Stage Non–Small Cell Lung Cancer Using Next-Generation Sequencing[J].?Clinical Cancer Research, 2017, 23(17): 5311-5319.來源：銳博生物