乳酸曾被認為是糖代謝過程無用的副產(chǎn)物，后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)乳酸在諸多分子機制的調(diào)控中起重要的調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)控巨噬細胞極化、輔助T細胞分化以及腫瘤細胞免疫監(jiān)控的調(diào)節(jié)。到目前為止，沒有確定乳酸的直接蛋白質(zhì)靶標，乳酸是否通過直接蛋白質(zhì)靶向參與其他細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和生物學分子機制仍有待確定。視黃酸誘導基因I樣受體(retinoic-acid inducible gene I -like receptor, RLR)可介導干擾素（IFN）的生產(chǎn)，作為先天免疫的重要組份對病毒清除和癌癥免疫監(jiān)視等方起關鍵作用。然而，乳酸對調(diào)節(jié)免疫細胞功能發(fā)揮的作用，以及乳酸是否參與RLR信號介導IFN的機理仍然不清楚。2019年5月，軍事醫(yī)學科學院生物醫(yī)學分析中心張維娜課題組最近與美國維克森林大學Hui-Kuan Lin合作在國際頂級期刊Cell發(fā)表學術論文：Lactate Is a Natural Suppressor of RLR Signaling by Targeting MAVS，發(fā)現(xiàn)乳酸竟然是靶向MAVS的RLR天然抑制劑，并闡明了乳酸參與RLR信號介導IFN的機理。
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? ? ?研究人員發(fā)現(xiàn)，糖酵解產(chǎn)物在RLR活化期間阻礙IFN的產(chǎn)生，RLR觸發(fā)MAVS-RIG-I識別己糖激酶，使己糖激酶與線粒體抗病毒信號傳導蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS)結(jié)合，導致己糖激酶的亞細胞定位和激活受損。研究還發(fā)現(xiàn)，乳酸通過直接結(jié)合MAVS跨膜（TM）結(jié)構域，阻止MAVS聚集從而抑制RLR介導的信號傳導。通過引入乳酸脫氫酶抑制劑調(diào)節(jié)乳酸脫氫酶的水平，發(fā)現(xiàn)當乳酸脫氫酶A（LDHA）失活導致的乳酸減少時，會增加I型IFN的產(chǎn)生，從而保護小鼠免受病毒感染。另外，炎癥狀態(tài)下，乳酸的補充可逆轉(zhuǎn)由乳酸缺乏引起的IFN產(chǎn)生增加。此研究確定了糖酵解衍生的乳酸在限制RLR信號傳導中的關鍵作用，并將MAVS鑒定為乳酸的直接傳感器，可作為能量代謝和先天免疫的樞紐。
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? ? ?在實驗中，研究人員采用siRNA沉默若干乳糖代謝相關基因（如：單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白MCT1、己糖激酶HK、乳酸脫氫酶LDHA等）轉(zhuǎn)錄水平的表達以研究乳糖與IFN、MAVS的作用關系 （siRNA: human MCT1來自于銳博生物的genOFF文庫產(chǎn)品，貨號為stB0007914A和stB0007914B）。
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? ? ?通過siRNA:human MCT1 對MCT1m RNA進行干擾，以阻礙細胞對乳酸的攝取和轉(zhuǎn)運，細胞水平為例，對照組中格外添加lactate的組較野生型IFN顯著下調(diào)，而SiRNA干擾MCT-1的兩平行組則無變化；在mRNA轉(zhuǎn)錄水平，qPCR檢測兩平行組均可降至20%左右，顯著性分析p < 0.01?？梢?，siRNA對MCT-1的干擾效果顯著，阻礙細胞對乳糖的攝入，為乳糖干擾IFN表達提供直觀的證據(jù)。
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1.通過LDHA揭示乳糖對RLR信號干擾
? ? ?乳糖脫氫酶LDHA是無氧糖酵解的關鍵酶，可催化丙酮酸生成乳酸。通過應用遺傳和藥理學方法探究LDHA相關乳酸是否在負調(diào)節(jié)I型IFN中發(fā)揮作用。結(jié)果表明，LDHA的敲低增強了TBK1和IRF3的磷酸化并增強RLR激活后的IFN-β產(chǎn)生（下圖A-D）。與LDHA敲低類似，使用LDHA抑制劑草氨酸鈉（sodium oxamate）可降低乳酸水平并增強IFN-β產(chǎn)生，從而抑制病毒復制（下圖E-H）此外，向草氨酸鈉處理的細胞中添加乳酸阻礙LDHA抑制劑對IFN-β促進的作用（下圖I）。乳酸的添加破壞了2-DG對IFN-β誘導及其上游信號傳導的影響（下圖J）。在己糖激酶HK敲低的細胞中也觀察到類似的結(jié)果（下圖K）。研究中還發(fā)現(xiàn)乳酸的添加恢復了半乳糖對IFN-b誘導和病毒復制的影響（下圖L）。
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LDHA敲低后對(A)乳糖的影響 (B)INF-β轉(zhuǎn)錄水平的影響 (C) INF-β蛋白水平的影響 (D)修復LDHA對INF-β轉(zhuǎn)錄水平的影響;添加LDHA抑制劑草氨酸鈉后對 (E)乳糖的影響 (F)INF-β轉(zhuǎn)錄水平的影響 (G)Sev病毒侵入下INF-β轉(zhuǎn)錄水平的影響 (H)對入侵病毒Sev復制的影響;細胞中添加乳酸前后（I）草氨酸鈉對IFN-β轉(zhuǎn)錄水平的影響（J）乳糖對2DG誘導IFN-β的影響（K）己糖激酶敲低下對IFN-β的影響（L）半乳糖對對IFN-β的影響
2. LDHA生產(chǎn)的乳酸通過靶向MAVS負調(diào)節(jié)RLR激活
? ? ?為確定乳酸對RLR信號傳導的作用的直接靶標，研究中利用生物素標記的乳酸進行測定；主要專注于參與RLR信號傳導激活的關鍵蛋白（包括RIG-I，MDA5，TBK1，MAVS和IRF3）發(fā)現(xiàn)乳酸與MAVS存在特異性相互作用（下圖A）、MAVS在不同生理條件下與乳酸鹽相互作用（圖B和C）。
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(A)免疫印跡分析生物素標記的乳酸結(jié)合物? (B) 熒光分析細胞的IgG及mavs抗體對乳酸相互作用 (C)熒光分析細胞的IgG及mavs抗體對乳酸相互作用丙酮酸相互作用
? ? ?為了探索乳酸和MAVS之間的詳細相互作用，研究人員對其結(jié)構域進行分析，發(fā)現(xiàn)乳酸-MAVS的結(jié)合需要MAVS中的TM結(jié)構域，通過合成MAVS的TM結(jié)構域（514-535aa）并對其N末端加上一段TAT標簽。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)TM肽能夠有效中斷乳酸與MAVS的結(jié)合。體內(nèi)實驗，通過人免疫缺陷病毒TAT中TAT肽的細胞穿透性（CPP）將大分子送到細胞中以測試它們的生物學功能。利用CPP將TM肽送進入細胞內(nèi)使用免疫熒光觀察（下圖J）確定了TM肽對RLR誘導的I型IFN產(chǎn)生的影響。此外，向細胞中添加TM肽可促進RLR活化（下圖K）并阻礙乳酸對IFN-b和IL-6產(chǎn)生的抑制作用（下圖L）。
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(A)MAVS染色TAT抗體染色，免疫熒光分析TM肽作用(B) TM肽轉(zhuǎn)染細胞后IFN-β表達的qPCR分析（C）qPCR分析經(jīng)草酸鈉、TM肽、乳酸對細胞IFN-β表達的影響
這些結(jié)果表明乳酸通過其與MAVS的TM結(jié)構域的結(jié)合來抑制RLR信號傳導。
3. 乳酸抑制MAVS線粒體定位、RIG-I-MAVS和MAVS聚合
? ? 為進一步揭示乳酸抑制RIG-I-MAVS誘導RLR活化的潛在機制，研究人員增加草氨酸鹽（乳酸脫氫酶抑制劑）抑制乳酸產(chǎn)生后， MAVS線粒體定位清晰，而添加乳酸后破壞了這種現(xiàn)象（圖A和B）。另外MAVS的TM結(jié)構域缺陷型不能在線粒體中定位且不能與活化的RIG-I相互作用（圖C）。
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(A)免疫熒光分析乳酸/草氨酸對MAVS的細胞定位的影響 (B)體免疫印跡分析乳酸/草氨酸對MAVS的細胞定位的影響 （C）體免疫印跡分析TM結(jié)構對RIG-I相互作用
? ?為探究乳酸對RIG-I MAVS的影響，研究中通過活化的RIG-I誘導體外MAVS聚集測定，并將乳酸鹽與活化的RIG-I蛋白及線粒體一起孵育。結(jié)果顯示當存在線粒體和K63連接的泛素鏈（K63-Ub4）的情況下，純化的GST-RIG-I（N）在體外觸發(fā)了顯著的MAVS聚集。另外，乳酸擁有顯著阻礙MAVS聚集的能力（圖F）。
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(圖F)體外MAVS聚集的免疫印跡分析
總之，本研究發(fā)現(xiàn)乳酸可靶向MAVS的TM結(jié)構域以阻礙其線粒體定位和RIG-I-MAVS復合物形成，從而損害MAVS聚集及其下游信號傳導激活，證明MAVS與乳酸的結(jié)合使MAVS線粒體定位破壞，從而減弱RLR信號傳導和下游I型IFN產(chǎn)生。文中討論部分提及癌細胞逃避免疫機制監(jiān)視的一個潛在機制可能與乳酸限制I型INF的產(chǎn)生有關，并為各種人類疾病（如病毒感染和癌癥）調(diào)控提供了重要的理論依據(jù)和策略：將MAVS的TM肽應用于治療中，不僅可以提高正常條件下IFN的產(chǎn)生，而且可以減輕乳酸對RLR介導的IFN產(chǎn)生的抑制作用；此外，有望通過靶向乳酸脫氫酶的藥物，抑制乳酸的生產(chǎn)以加強宿主先天免疫反應，提高I型干擾素生產(chǎn)來病毒清除和癌癥免疫監(jiān)測。
詳情請查閱原文：Weina Zhang, Guihua Wang, Zhi-Gang Xu et al., Lactate Is a Natural Suppressor of RLR Signaling by Targeting MAVS [J] Cell 178, 1–14?https://doi.prg/10.1016/j.cell.2019.05.003來源：銳博生物