今日凌晨，《科學(xué)》雜志發(fā)表麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué) Broad 研究所張鋒團(tuán)隊(duì)最新文章，他們開發(fā)的一種名為 RESCUE 的全新 CRISPR 基因編輯技術(shù)，可以進(jìn)行以前不可能進(jìn)行的 RNA 單堿基編輯。

具體而言，張鋒團(tuán)隊(duì)利用 dCas13 引導(dǎo) RESCUE 有針對(duì)性地靶向轉(zhuǎn)錄RNA中的胞嘧啶堿基（C），并使用一種改進(jìn)后的全新 ADAR2 酶把不需要的胞嘧啶堿基（C）精確地修改為尿嘧啶堿基（U），從而改變 RNA 的指令，達(dá)到不修改 DNA 也可實(shí)現(xiàn)改變蛋白質(zhì)的目的。

RESCUE 極大擴(kuò)展了 CRISPR 技術(shù)在 RNA 編輯領(lǐng)域的應(yīng)用，包括蛋白質(zhì)中可修改的特定位置，比如磷酸化位點(diǎn)。這些位點(diǎn)在蛋白質(zhì)的功能中起著決定性的作用，在信號(hào)分子和癌癥相關(guān)通路中尤為明顯。

“為了治療引起疾病的基因變異多樣性，我們需要一系列精確的技術(shù)來選擇。通過開發(fā)這種新的酶，并將其與 CRISPR 的可編程性和精確性相結(jié)合，我們填補(bǔ)了 CRISPR 工具箱中的一個(gè)關(guān)鍵空白?！睆堜h教授表示。

越來越豐富的 CRISPR 工具包

真核生物的基因組由數(shù)十億個(gè) DNA 堿基組成，精確靶向目的基因并修改這些 DNA 堿基序列，對(duì)整個(gè)分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展都具有巨大價(jià)值。我們熟悉的通過病毒轉(zhuǎn)染將基因片段插入目的基因組，就是科學(xué)家們對(duì)于基因編輯最初的努力。但是，這樣的基因編輯方法，既耗時(shí)耗力，又難以精確實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的。

30 多年前，科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)一段規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列，并發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)序列可讓細(xì)菌對(duì)病毒有免疫抗性。2001 年，西班牙科學(xué)家 Francisco Mojica 正式將其命名為 CRISPR。

2012年，兩位女科學(xué)家，來自加州大學(xué)伯克利分校的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）和瑞典于默奧大學(xué)的埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）首次將 CRISPR/Cas 作為基因編輯系統(tǒng)應(yīng)用。

之后，來自于哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的 George Church、麻省理工學(xué)院 Broad 研究所的張鋒以及加州大學(xué)舊金山分校系統(tǒng)及合成生物學(xué)中心的亓磊（目前就職于斯坦福大學(xué)），分別發(fā)表三篇文章，將 CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)首次成功應(yīng)用到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。

圖 | 張鋒教授（來源：麻省理工科技評(píng)論）

CRISPR/Cas 的出現(xiàn)，引領(lǐng)了整個(gè)基因編輯領(lǐng)域爆炸式的發(fā)展，并徹底改變了我們修改疾病相關(guān)基因突變的能力。

而自 2012 年 CRISPR 基因組編輯工具正式出現(xiàn)以來，已發(fā)表了 9000 多篇相關(guān)的研究論文。眾多科學(xué)家不斷改進(jìn) CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)，將其從單一的“基因剪刀”擴(kuò)展成多功能的“基因工具包”，包括靶向 DNA 的 Cas9 和 Cas12 酶，靶向 RNA 的 Cas13 酶。不斷豐富的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)也展現(xiàn)出令人興奮的廣闊應(yīng)用前景。

但是，對(duì) DNA 的編輯修改，意味著對(duì)基因組不可逆的永久性改變，這一過程也目前面臨著不可回避的安全風(fēng)險(xiǎn)和倫理問題。此外，一些細(xì)胞類型，比如神經(jīng)元，很難使用 CRISPR/cas9 介導(dǎo)的編輯對(duì) DNA 進(jìn)行修改，這也就限制了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療應(yīng)用。

于是，一種僅編輯修改 RNA 的基因編輯策略被科學(xué)家們提了出來。

DNA 是遺傳信息的載體，RNA 作為 DNA 轉(zhuǎn)錄出來的中間產(chǎn)物，負(fù)責(zé)指導(dǎo)下游蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。因此，針對(duì)與疾病相關(guān)的基因突變，僅短暫對(duì) RNA 突變進(jìn)行修改，既避免了對(duì)基因組的不可逆修改，又實(shí)現(xiàn)了突變蛋白質(zhì)的糾正。

全新的 RESCUE 系統(tǒng)

2017 年，張鋒團(tuán)隊(duì)就在《科學(xué)》雜志發(fā)表了一項(xiàng)針對(duì) RNA 編輯的全新 CRISPR 系統(tǒng)——REPAIR，在這款RNA編輯器中，研究人員將高效靶向 RNA 的 Cas13b 蛋白與 ADAR2 酶結(jié)合在一起，將 REPAIR 編輯系統(tǒng)引導(dǎo)至特定的 RNA 位置，特異性地將 RNA 上的腺嘌呤堿基（A）修改為與鳥嘌呤堿基（G）結(jié)構(gòu)類似的肌苷（I）。

對(duì)于細(xì)胞而言，肌苷與鳥嘌呤堿基十分相像，能夠以鳥嘌呤的身份合成具有正常生理功能的蛋白質(zhì)。因此，REPAIR 編輯系統(tǒng)相當(dāng)于實(shí)現(xiàn)了有效地對(duì) RNA 中的腺嘌呤（A）進(jìn)行單堿基編輯。

通過對(duì) REPAIR 編輯系統(tǒng)的改進(jìn)升級(jí)而來的全新 RESCUE 編輯系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)直接將 RNA 中的胞嘧啶堿基（C）直接修改為尿嘧啶堿基（U）。RESCUE 編輯系統(tǒng)能夠被引導(dǎo)到到任何 RNA 中，然后通過優(yōu)化的 ADAR2 組件平臺(tái)執(zhí)行由 C 到 U 的 RNA 編輯任務(wù)。

圖 | 由堿基 C 到堿基 U，和由堿基 A 到 I 的原理圖（來源：Science）

在最新發(fā)表的論文中，研究人員還將這個(gè)新平臺(tái)應(yīng)用到人類細(xì)胞中，與實(shí)驗(yàn)室中合成 RNA 中有效修改 24 個(gè)臨床相關(guān)突變一樣，RESCUE 編輯系統(tǒng)成功靶向了人類細(xì)胞中的天然 RNA。

研究人員表示，接下來他們將進(jìn)一步優(yōu)化 RESCUE 編輯系統(tǒng)，以減少目標(biāo)外的編輯，同時(shí)最小化目標(biāo)內(nèi)編輯的干擾。

RESCUE 編輯系統(tǒng)的誕生，意味著翻譯后修飾調(diào)控許多蛋白質(zhì)活性和功能的位點(diǎn)，如磷酸化、糖基化和甲基化，現(xiàn)在可以更容易地成為編輯的目標(biāo)。

為了驗(yàn)證 RESCUE 編輯系統(tǒng)的這種應(yīng)用潛力，研究人員在人類細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，RESCUE 編輯系統(tǒng)可以精準(zhǔn)靶向編碼 β-catenin 蛋白（β-catenin 蛋白已知在蛋白質(zhì)磷酸化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用）的 RNA 特殊位點(diǎn)，引起 β-catenin 蛋白活性的臨時(shí)增加，并促進(jìn)細(xì)胞生長。

如果這樣的變化是永久性的，它可能會(huì)使細(xì)胞不受控制地生長進(jìn)而發(fā)展為癌癥。但現(xiàn)在通過使用 RESCUE 編輯系統(tǒng)，短暫的細(xì)胞生長可以實(shí)現(xiàn)促進(jìn)傷口愈合，應(yīng)對(duì)急性損傷。

圖 | 在 RESCUE 編輯系統(tǒng)中，酶 Cas13（粉紅色）使用向?qū)Вt色）來定位細(xì)胞中的 RNA（藍(lán)色）（來源：Stephen Dixon）

此外，研究人員還將目光瞄準(zhǔn)了一種致病基因變體?APOE4。APOE4?等位基因一直是晚發(fā)性阿爾茨海默病發(fā)病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素，與?APOE4?只有兩個(gè)堿基區(qū)別的?APOE2（APOE4?中的兩個(gè)堿基 C，對(duì)應(yīng)著?APOE2?中的兩個(gè)堿基 U），卻不是阿爾茨海默病的危險(xiǎn)因素。

于是，張鋒團(tuán)隊(duì)將與疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的?APOE4?RNA 進(jìn)入細(xì)胞中，通過 RESCUE 編輯系統(tǒng)成功將?APOE4?中的兩個(gè)堿基C，修改為?APOE2?序列，這本質(zhì)上相當(dāng)于能夠?qū)y帶APOE4?基因的阿爾茨海默病高風(fēng)險(xiǎn)人群，風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)化為無。

為了將 RESCUE 編輯系統(tǒng)作為一種廣泛使用的工具，更好地推向臨床應(yīng)用，張鋒實(shí)驗(yàn)室計(jì)劃將 RESCUE 編輯系統(tǒng)向?qū)W術(shù)界免費(fèi)共享，在此之前，他們開發(fā)的 CRISPR 工具，也都向用于學(xué)術(shù)研究的科學(xué)家們免費(fèi)共享。

來源：MIT科技評(píng)論