重大進展！5000例臨床全基因組測序揭示腫瘤環(huán)狀DNA全貌！再邀吳思涵獨家解讀自然新發(fā)現(xiàn)
今日，Nature Genetics《自然·遺傳學》雜志刊登了有關腫瘤染色體外環(huán)狀DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA）研究的重大進展。論文首次在大量的腫瘤臨床樣本中證明了ecDNA的存在，并進一步證實了其作為一種癌基因的載體，具有活躍轉錄能力，以及高度開放的染色質，并且與腫瘤患者的死亡風險相關。論文作者由來自Jackson Laboratory的TCGA科學家Roel Verhaak教授團隊，來自加州大學圣迭戈分校（UCSD）人類基因組計劃科學家Vineet Bafna教授團隊，以及來自UCSD醫(yī)學院腫瘤遺傳與ecDNA領域的領軍實驗室Paul Mischel教授團隊組成。在2019年年底，該團隊已在Nature《自然》雜志上刊登了有關腫瘤ecDNA結構與功能的研究。在今日上線的論文中，該團隊通過生物信息學方法，對The Cancer Genome Atlas（TCGA，腫瘤基因組圖譜計劃）及Pan-Cancer Analysisof Whole Genomes（PCAWG，泛腫瘤全基因組分析計劃）數(shù)據(jù)庫中、共計5022例臨床腫瘤及正常組織對照的全基因組測序數(shù)據(jù)，進行了重分析，完整描述了ecDNA的序列結構以及臨床意義。（圖片引自吳思涵博士2019年的Nature論文）研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中擴增的癌基因，可以從染色體上脫落下來，形成環(huán)狀的DNA，即ecDNA。由于其特殊的物理結構以及細胞遺傳形式，ecDNA能快速地推動腫瘤的進展，并導致腫瘤耐藥。去年11月，肽度TIMEDOO邀請了ecDNA領域的專家吳思涵博士，以第一作者身份解讀了刊登在Nature《自然》雜志上里程碑式的研究論文：今天，我們很榮幸再度邀請該項目的參與者吳思涵博士，第一時間為大家?guī)愍毤医庾x。肽度TIMEDOO：時隔一年，腫瘤環(huán)狀ecDNA領域又有重大進展。相比上一次您發(fā)表在Nature上的論文，本次研究有什么新的進展？吳思涵博士：上一次的研究，我們的重心是對腫瘤ecDNA的結構與功能進行細致解讀，通過超高分辨率顯微成像結合多種測序技術，首次闡明了ecDNA的環(huán)狀結構，并揭示了其基本分子生物學功能，同時也為后續(xù)的研究奠定了許多理論以及技術的基礎。那個時候，我們的研究模型是體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系。本次發(fā)表在Nature Genetics的研究，我個人是以“打輔助”的角色參與的，主要提供理論以及影像學數(shù)據(jù)的支持。首先，我們再度證明了全基因組測序和AmpliconArchitect算法，在鑒定ecDNA中的可靠性。我們將此研究方法，與數(shù)千張“金標準”的顯微鏡照片進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者具有高度的一致性。同時我們還與專門用于捕獲環(huán)狀DNA的CIRCLE-seq法進行了比較，發(fā)現(xiàn)了幾乎100%的吻合度。同時，我們進一步優(yōu)化了算法，將腫瘤中的擴增片段分為Circular（環(huán)狀）、Breakage-fusion-bridge（BFB，斷裂-融合-橋接）、Heavily rearranged（高度重排）、以及Linear（線性）四類。經過統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，ecDNA在多種瘤種中是廣泛存在的。其中，有將近50%的腦膠質母細胞瘤和骨肉瘤中都含有ecDNA。而常見的肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌等腫瘤中，也常見ecDNA形式的基因擴增。但在淋巴瘤、白血病，還有諸如腎癌、前列腺癌中，ecDNA較為罕見。第二，我們在數(shù)千例腫瘤臨床樣本中，再度證明了環(huán)狀ecDNA是癌基因的載體。比如，經典的EGFR、MDM2、AKT1、CDK4等原癌基因，通常是以ecDNA的形式進行擴增的。與我們上一個研究相吻合的是，由于ecDNA的拷貝數(shù)高，而且染色質更加開放，因此，ecDNA上的基因的表達量，往往高于比其他形式的基因擴增。同時，我們還發(fā)現(xiàn)了，ecDNA還是基因融合的一種重要機制。尤其是在拷貝數(shù)高的情況下，在ecDNA上發(fā)生的基因融合，要比其他形式的基因擴增更加頻繁。最后，我們還有一個重要的發(fā)現(xiàn)：攜帶ecDNA的腫瘤患者，其預后要比其他患者更差。我們先是統(tǒng)計了不同分組患者的五年生存率，發(fā)現(xiàn)攜帶ecDNA的腫瘤患者，其五年生存率是最低的。但是，直接比較五年生存率是不公平的。因為研究數(shù)據(jù)是多種不同腫瘤的混合，而有一些腫瘤，同時兼具生存期短以及高ecDNA比例的特征（比如腦膠質母細胞瘤），因此會造成數(shù)據(jù)上的偏倚。當然了，這也說明，ecDNA會傾向于在更加致命的腫瘤中出現(xiàn)。為了矯正這樣的偏倚，我們進一步采用了多變量Cox比例風險模型的研究方法，最后發(fā)現(xiàn)，攜帶ecDNA的腫瘤患者其死亡風險是最高的。與沒有基因擴增的患者相比，其死亡風險要高出48.2%。△攜帶ecDNA的腫瘤患者具有更高的死亡風險
肽度TIMEDOO：這項研究有什么現(xiàn)實意義呢？吳思涵博士：首先是在大量的臨床腫瘤樣本中證明了ecDNA是廣泛存在的。此前，我們的研究僅停留在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞樣本，對ecDNA在臨床中的認識仍存在空白。這一次的研究正面回應了這個問題，并對每一種常見腫瘤的ecDNA陽性百分比進行了統(tǒng)計，明確了ecDNA在何種腫瘤中具有更高的研究價值。其次是再次支持了去年我們對ecDNA的研究成果，在大數(shù)據(jù)中證明了之前小范圍研究的正確性，包括ecDNA的染色質特征以及轉錄特征。最后，也是最關鍵的，是首次在大樣本中研究了ecDNA與腫瘤患者生存率的關系。我們發(fā)現(xiàn)，ecDNA腫瘤患者的預后更差。雖然這篇文章中的數(shù)據(jù)只是解釋了相關性，但結合我們以及其他實驗室的一系列論文，包括ecDNA攜帶并大量轉錄經典的原癌基因，ecDNA介導了腫瘤耐藥等研究，我們不難合理地推斷其中的因果關系。這也就說明了，我們急需針對ecDNA研發(fā)治療手段。而這與深入研究ecDNA背后的各種生物學機制是分不開的。此外，我們的研究也奠定了ecDNA的相關研究手段。從實驗上，二代全基因組測序結合計算機分析可以鑒定ecDNA。當然，長讀長的測序技術將來也會是重要的研究手段，而且理論上會有更高的準確度，只不過在現(xiàn)階段，成本還相對較高。計算分析的算法也在逐步優(yōu)化。去年我們僅將腫瘤的擴增基因識別為Circular環(huán)狀和Linear線性兩類，在今年的研究中，我們融合了鑒定BFB和Heavily rearranged的算法。目前，該算法還處于持續(xù)開發(fā)階段。兩周前我們還討論了如何進一步提高其準確率和特異性。不過，新版本的分析算法就需要等到下一篇論文發(fā)表時才同步公布了。肽度TIMEDOO：腫瘤ecDNA領域將往什么方向發(fā)展呢？吳思涵博士：這個問題可以從基礎和臨床轉化兩個角度來談。1、在基礎研究方面，雖然我們已經闡明了ecDNA的環(huán)狀結構，并揭示了其染色質、轉錄、3D相互作用等分子特征，也明確了其促進腫瘤與介導耐藥的功能，但是，我們對ecDNA的認識還不夠充分。比如這些問題尚未有明確答案：ecDNA是怎么產生的？腫瘤細胞又是通過何種機制來維持ecDNA的存在的？在本項研究中，我們發(fā)現(xiàn)部分構成ecDNA的片段具有染色體災變（chromothripsis）的特征。染色體災變是一種高度復雜的染色體DNA重排現(xiàn)象，它是由染色體高度碎片化，產生數(shù)個甚至數(shù)千計的DNA碎片，并隨機地重新組合在一起的過程。染色體災變在腫瘤中是廣泛存在的。此前，在我們樓上的Don Cleveland教授團隊證明，染色體災變可以在生成ecDNA。然而，經過對數(shù)千樣本、數(shù)萬DNA片段的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，染色體災變最多僅能解釋約36% ecDNA的起源，另外大部分ecDNA的產生機制，依然不明確。總而言之，雖然腫瘤ecDNA領域近幾年取得了不少突破，但我們對它的了解依然不夠全面、深刻。2、在臨床轉化方面，從診斷到治療，都是個大缺口。首先，我們迫切需要研發(fā)出廉價、快速的檢查ecDNA的手段。盡管在基礎研究中，全基因組測序法具有相當高的可靠性，多數(shù)實驗室也能負擔得起，但是對于腫瘤患者來說，成本顯然還是太高了。粗略估計，用全基因組測序法，并考慮采樣、數(shù)據(jù)分析中所涉及的人力、試劑與耗材成本，進行一次檢測可能需要800-1000美金，而這還僅僅是面向科研的、營利目的不強的報價。若是商業(yè)化的臨床檢測，考慮到臨床檢測資質以及商業(yè)盈利，最終的報價會更高，這對患者來說是一筆不小的負擔。當然，這個成本在未來應該會再一步降低。希望在相應的靶向ecDNA的療法問世的同時，檢測的費用也能降到多數(shù)腫瘤患者能夠負擔的范圍內。緊接著，是如何將基礎研究與臨床轉化相結合，造福腫瘤患者。假設我們有辦法闡明ecDNA的具體生物學機制，我們或許能針對這些機制，設計專門的靶向治療手段。特別地，有些重要的原癌基因特別難開發(fā)藥物實現(xiàn)靶向治療。比如大名鼎鼎的原癌基因MYC，整個領域至少花了20年的時間，仍然沒有研發(fā)出具有成藥價值的直接靶向手段，通常只能是間接地去影響MYC的功能或者表達。不過，在一些癌種中，MYC偏好以ecDNA的形式擴增。假如我們有辦法直接靶向ecDNA，就能繞過靶向MYC的技術障礙，從而為腫瘤治療提供新的思路。此外值得補充的是，在正常的真核細胞中，也存在著環(huán)狀DNA，稱為eccDNA。它的拷貝數(shù)低，體積小并因而通常不攜帶完整的編碼基因，但可攜帶小RNA基因。但是，相比腫瘤大型ecDNA研究領域，eccDNA與人類健康的研究相對滯后。我相信，闡明在正常細胞中存在的小型eccDNA的功能，也是亟待探索的領域。肽度TIMEDOO：目前國內市場對ecDNA的認知是否存在偏差？吳思涵博士：這里我僅能對科研服務市場做相關的點評。而在臨床轉化方面，無論國內外都是在早期項目探索、孵化階段，因而暫不做評論。在2019年年底3篇圍繞腫瘤ecDNA的重磅論文發(fā)表后，我看到不少科研技術服務公司紛紛推出了相關的ecDNA檢測服務。不過，這些公司在宣傳上是有所偏差的。首先是混淆了在正常細胞中存在的小型環(huán)狀eccDNA，以及腫瘤中存在的具有促癌性質的大型ecDNA的概念。如前述，eccDNA與人類健康、疾病之間的因果關系尚不明確（在低等生物中如酵母，倒是有明確的功能，如與衰老、抗逆性相關）。而有關腫瘤ecDNA的功能，兩次訪談已經闡述了不少，簡而言之就是促癌以及介導耐藥。但是我看不少公司宣傳文案上，并沒有將兩者加以區(qū)分，而是混雜在一起談，顯然會引起誤會。而正因為eccDNA與ecDNA兩者的性質不同，所以在檢測技術以及后續(xù)的計算分析中，也是有不同的方案的。對于eccDNA來說，哥本哈根大學Birgitte Regenberg教授團隊的方案是比較成熟的。目前也有來自弗吉尼亞大學Anindya Dutta教授的團隊在探索用ATAC-seq的方法來鑒定eccDNA。而對于腫瘤ecDNA來說，我們團隊所開發(fā)的全基因組+AmpliconArchitect方案兼具實驗路線簡單與成本相對低廉的優(yōu)勢。我們也用金標準的影像學數(shù)據(jù)進行交叉驗證，證明了該技術路線的可靠性。我還看到有些公司宣傳用Sanger測序的方法去驗證全基因組測序的結果。這實際上是一個天大的誤會。我們在去年的Nature文章附圖中，確實是使用了Sanger測序的方法。但是，那只是為了回答一個不懂行的審稿人的問題。實際上，二代全基因組測序已經足夠回答問題。在常規(guī)30X的測序中，ecDNA上每一個breakpoint都有數(shù)十甚至上百條reads來支持，因此再使用Sanger測序是多余的。△在經典二代全基因組測序中，ecDNA上的每一個breakpoint都有大量的測序reads來支持當然，這些認識上的偏差背后是有原因的，一是該領域相對來說探索較少，有許多尚不明確的科學問題，二是其研究范式仍在處于早期建設階段。數(shù)月前我們已經收到了Annual Review雜志社的邀請，為ecDNA領域撰寫一份年鑒綜述。除了對ecDNA領域過去50年近百篇研究論文進行整理、總結外，我們還計劃用一章內容，系統(tǒng)梳理ecDNA的研究方法。我們也希望屆時收錄的年鑒，能夠成為引導科研人員進入ecDNA研究領域的指南。— 專訪華人科學家 —
美國加州大學圣迭戈分校醫(yī)學院博士后，專職從事腫瘤遺傳學與基因組學研究，曾在Nature，Nature Reviews Cancer等期刊發(fā)表數(shù)十篇研究與綜述論文。請聯(lián)系domchow2012（微信號）獲轉載授權
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