北京大學(xué)：李毓龍實(shí)驗(yàn)室與合作者實(shí)現(xiàn)新型紅色熒光多巴胺探針和第二代綠色熒光多巴胺探針的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用
多巴胺（Dopamine, DA）作為大腦中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與運(yùn)動(dòng)控制、動(dòng)機(jī)、學(xué)習(xí)、記憶、情緒等生理過(guò)程，以及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、成癮、精神分裂癥、多動(dòng)癥和創(chuàng)傷后壓力綜合征等密切相關(guān)。為更好地研究多巴胺在生理和病理過(guò)程中的作用，研究人員需要一種能夠?qū)崟r(shí)、靈敏、特異地檢測(cè)多巴胺的工具，以研究在活體模式生物中、復(fù)雜行為模式下多巴胺信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化情況。自2018年起，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李毓龍實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了一系列檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的熒光探針，即GRAB探針系列，其中即包括多巴胺探針（GRABDA）。該探針克服了已有多巴胺檢測(cè)手段中時(shí)空分辨率低、分子特異性差等諸多問(wèn)題，已被廣泛地應(yīng)用于活體果蠅、小鼠、斑馬魚、斑馬雀等模式生物[1-4]。
2020年10月22日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室、紐約大學(xué)Dayu Lin實(shí)驗(yàn)室和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院Guohong Cui實(shí)驗(yàn)室合作，在Nature Methods在線發(fā)表了題為“Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo”的研究論文，報(bào)告了新型紅色熒光多巴胺探針和第二代綠色熒光多巴胺探針的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用。
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論文截圖
研究人員在發(fā)表的第一代探針的基礎(chǔ)上，對(duì)多巴胺探針進(jìn)行了進(jìn)一步的改造和優(yōu)化。這項(xiàng)工作的亮點(diǎn)之一為開(kāi)發(fā)出新型的具有紅色熒光的多巴胺探針（rGRABDA1m和rGRABDA1h），可與其它綠色熒光探針（如鈣離子探針、神經(jīng)遞質(zhì)探針等）共同使用，實(shí)現(xiàn)多種信號(hào)的同時(shí)記錄。工作亮點(diǎn)之二為優(yōu)化出具有更高靈敏度及成像信噪比的第二代綠色熒光多巴胺探針（GRABDA2m和GRABDA2h）（下圖），其較第一代探針在反應(yīng)幅度上提升了2～3倍。
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新型紅色熒光多巴胺探針和第二代綠色熒光多巴胺探針在HEK293T細(xì)胞中的熒光響應(yīng)情況
針對(duì)新一代多巴胺探針，研究者在細(xì)胞、腦片、果蠅（上圖）、小鼠（下圖）中對(duì)其表現(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的刻畫，并通過(guò)一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)探針信號(hào)的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證，為該工具的未來(lái)應(yīng)用提供了詳盡的信息。應(yīng)用新一代靈敏的多巴胺探針，研究者在清醒的、自由活動(dòng)的動(dòng)物深部腦區(qū)記錄了多巴胺的動(dòng)態(tài)變化，并研究了多巴胺隨著動(dòng)物不同精細(xì)行為過(guò)程發(fā)展而產(chǎn)生的變化（下圖）。
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通過(guò)雙光子成像法檢測(cè)果蠅大腦中由氣味刺激和電刺激引發(fā)的多巴胺釋放
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通過(guò)光纖記錄法檢測(cè)小鼠交配行為中NAc腦區(qū)的多巴胺動(dòng)態(tài)變化情況
這些新型多巴胺探針不僅為多巴胺功能的研究提供了重要工具，也為將來(lái)開(kāi)發(fā)具有多種光譜范圍以及更高信噪比的神經(jīng)遞質(zhì)探針提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)?！盎贕蛋白偶聯(lián)受體”這一探針開(kāi)發(fā)策略已被應(yīng)用于開(kāi)發(fā)多種神經(jīng)遞質(zhì)探針，包括乙酰膽堿探針[5,6]、去甲腎上腺素探針[7]、腺苷探針[8]、五羥色胺探針[9]、內(nèi)源大麻素探針[10]、美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校Lin Tian實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的多巴胺探針等[11,12]。實(shí)驗(yàn)室期待未來(lái)將會(huì)有更多具有更高信噪比、多種光譜范圍的神經(jīng)遞質(zhì)探針，推進(jìn)大腦神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能的研究。
參考文獻(xiàn)：
1. Sun, F. et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid andspecific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell 174, 481–496.e9(2018).
2. Tanaka, M., Sun, F., Li, Y. & Mooney, R. A mesocortical dopamine circuitenables the cultural transmission of vocal behaviour. Nature 563, 117–120(2018).
3. Zhou, M. et al. Suppression of GABAergic neurons through D2-like receptorsecures efficient conditioning in Drosophila aversive olfactory learning. Proc.Natl Acad. Sci. USA 116, 5118–5125 (2019).
4. Handler, A. et al. Distinct dopamine receptor pathways underlie the temporalsensitivity of associative learning. Cell 178, 60–75.e19 (2019).
5. Jing, M. et al. A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator forin vitro and in vivo studies. Nat. Biotechnol. 36, 726–737 (2018).
6. Jing, M. et al. An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity. Nature Methods (2020): 1-8.
7. Feng, J. et al. A genetically encoded fluorescent sensor for rapid and specificin vivo detection of norepinephrine. Neuron 102, 745–761.e8 (2019).
8.Peng, W. et al. Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science 369.6508 (2020).
9.Wan, J. et al. A genetically encoded GRAB sensor for measuring serotonin dynamics in vivo. bioRxiv (2020).
10.Dong, A. et al. A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved endocannabinoid dynamics in vitro and in vivo. bioRxiv (2020).
11.Patriarchi, T. et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics withdesigned genetically encoded sensors. Science 360, 6396 (2018).
12.Patriarchi, T. et al. An expanded palette of dopamine sensors for multiplex imaging in vivo. Nature Methods (2020): 1-9.
來(lái)源：北京大學(xué)
