人類的妊娠效率很低，自然妊娠中只有不到50%的胚胎能夠發(fā)育至足月。部分流產(chǎn)胚胎主要是源于胚胎的非整倍體染色體異常，在移植胚胎前鑒定并排除非整倍體胚胎是輔助生殖領域面臨的巨大挑戰(zhàn)。當前臨床上多采用對植入前胚胎的滋養(yǎng)外胚層進行樣品活檢和遺傳學檢測的方式來分析胚胎細胞的染色體倍性。該方法因涉及侵入性的胚胎細胞活檢，操作繁瑣，無法避免對胚胎造成一定程度的機械損傷。以檢測體外培養(yǎng)胚胎的培養(yǎng)液中游離DNA為代表的無創(chuàng)植入前胚胎遺傳學檢測，因沒有對胚胎本身進行取樣操作，能夠避免上述問題，但無創(chuàng)檢測的一個難點在于對培養(yǎng)液中游離DNA的細胞溯源，這直接關乎無創(chuàng)檢測方法的檢測準確性。

論文截圖

2021年6月15日，北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、生命科學學院湯富酬教授/文路副研究員團隊與北京大學第三醫(yī)院喬杰教授/黃錦副主任醫(yī)師團隊合作在The Journal of Clinical Investigation雜志發(fā)表題為“DNA methylome reveals cellular origin of cell-free DNA in spent medium of human preimplantation embryos”的研究論文。該研究對194例體外培養(yǎng)胚胎的培養(yǎng)液（spent embryo culture media，SECM）進行微量DNA甲基化組測序（Post–bisulfite adaptor tagging–based single-cell whole-genome DNA methylation sequencing, scBS-seq），通過和此前該團隊合作發(fā)表的植入前胚胎的單細胞DNA甲基化組圖譜進行系統(tǒng)比較分析，鑒定了培養(yǎng)液中游離DNA（cell free DNA，cfDNA）的準確細胞來源，并在此基礎上精準定量了培養(yǎng)液中的來自顆粒細胞的母源DNA污染，進而實現(xiàn)了系統(tǒng)的整合分析（圖1）。

圖1 胚胎培養(yǎng)液cfDNA甲基化圖譜研究示意圖

胚胎培養(yǎng)液游離DNA中存在來自母體顆粒細胞的游離DNA污染

該研究將培養(yǎng)液游離DNA的甲基化與植入前胚胎細胞和顆粒細胞基因組DNA的甲基化進行了系統(tǒng)的非監(jiān)督分析，發(fā)現(xiàn)50/191 SECM與顆粒細胞聚為一類，這些SECM呈現(xiàn)較高的全基因組甲基化水平，與顆粒細胞的全基因組甲基化水平接近（圖2A）。

為了進一步量化SECM中顆粒細胞污染來源的DNA比例，研究鑒定了769個顆粒細胞特異高甲基化的差異甲基化區(qū)域（C-DMRs），這些差異甲基化區(qū)域在顆粒細胞中高度甲基化，而在植入前胚胎細胞基因組DNA中近乎零甲基化（圖2B）。根據(jù)C-DMRs的甲基化水平，將不同的SECM樣品分為無顆粒細胞污染的樣品、顆粒細胞中度污染的樣品、顆粒細胞重度污染的樣品三組，結果顯示隨著顆粒細胞污染比例的增加，SECM樣品的總體甲基化水平相應增加，表明SECM的總體甲基化水平高很大程度上是由顆粒細胞來源的游離DNA污染引起的（圖2C）。

圖2 胚胎培養(yǎng)液（SECM）中存在顆粒細胞污染。（A）SECM與植入前胚胎細胞、顆粒細胞非監(jiān)督聚類分析；（B）769個顆粒細胞特異高甲基化區(qū)域（C-DMRs）；（C）三類SECM的全基因組甲基化水平

胚胎培養(yǎng)液游離DNA中存在來自胚胎極體細胞的游離DNA污染

為了進一步探究無顆粒細胞污染的SECM中游離DNA的準確來源，該研究繼續(xù)將培養(yǎng)液游離DNA的甲基化與植入前胚胎細胞的基因組甲基化進行了系統(tǒng)的非監(jiān)督聚類分析，結果顯示3/96 SECM與MII期卵細胞與雌原核的基因組DNA聚為一類（圖3A）。由于胚胎在體外培養(yǎng)過程中仍在持續(xù)發(fā)育，因此卵細胞中雌原核的基因組DNA不會被釋放到培養(yǎng)液中，據(jù)此推測胚胎培養(yǎng)液游離DNA的來源是排出胚胎外的極體細胞。

為了進一步量化SECM中污染的極體細胞游離DNA的比例，研究鑒定了548個卵/極體細胞特異高甲基化的差異甲基化區(qū)域（O-DMRs），這些區(qū)域在卵細胞和雌原核中高度甲基化，而在植入前胚胎細胞以及顆粒細胞中低甲基化（圖3B）。據(jù)文獻報道，非CpG的甲基化水平在卵母細胞中顯著高于其他植入前階段的胚胎細胞。在無顆粒細胞污染的SECM中，CHG和CHH(非CpG)的甲基化水平與O-DMRs甲基化水平呈正相關，表明SECM中有時存在極體細胞污染（圖3C）。

圖3 胚胎培養(yǎng)液（SECM）中存在極體細胞污染。（A）無顆粒細胞污染的SECM與植入前胚胎細胞、顆粒細胞非監(jiān)督聚類分析；（B）548個卵/極體細胞特異高甲基化區(qū)域（O-DMRs）；（C）無顆粒細胞污染的SECM中非CpG甲基化水平與O-DMRs甲基化水平的關系

胚胎培養(yǎng)液游離DNA中母源DNA污染率的推導

利用769個C-DMRs和548個O-DMRs的甲基化水平數(shù)據(jù)，該研究團隊建立計算方法推導了胚胎培養(yǎng)液游離DNA中顆粒細胞和極體細胞DNA組分的比例。首先，通過計算機生成一系列摻入不同比例的ICM/TE和顆粒細胞、極體細胞的模擬混合數(shù)據(jù)，再利用該計算方法計算顆粒細胞和極體細胞的百分比，發(fā)現(xiàn)計算得到的比例與實際摻入的比例高度吻合，這表明該計算方法的準確性很高（圖4A）。

接著該研究計算了實際培養(yǎng)液游離DNA中各組分的比例，發(fā)現(xiàn)1/3的胚胎培養(yǎng)液游離DNA樣本中存在顆粒細胞污染，且22%的樣本顆粒細胞污染比例超過60%以上。1/3的胚胎培養(yǎng)液游離DNA樣本存在極體細胞污染，4%的樣本是極體污染超過60%以上。說明通常情況下在胚胎培養(yǎng)液游離DNA中顆粒細胞污染比極體細胞污染更嚴重。

隨后，該研究定義了顆粒細胞和極體細胞污染比例之和為凈母源污染，發(fā)現(xiàn)只有1/3的胚胎培養(yǎng)液游離DNA樣品不存在明顯的母源污染，將近1/3的胚胎培養(yǎng)液游離DNA樣本存在嚴重的母源污染（圖4B）。

圖4 胚胎培養(yǎng)液（SECM）中母源DNA污染率推導。（A）計算機模擬數(shù)據(jù)驗證計算方法的準確性；（B）實際SECM中母源DNA污染比例統(tǒng)計

胚胎培養(yǎng)液游離DNA母源污染與染色體非整倍性的整合分析

DNA甲基化測序可以推斷染色體拷貝數(shù)（CNV）的情況。該研究在細胞系中評估了單細胞BS-seq推斷拷貝數(shù)結果的準確性，發(fā)現(xiàn)單細胞BS-seq得到的拷貝數(shù)和用MALBAC得到的結果一致，同時所需的起始量很低（圖5A）。該研究還探究了胚胎培養(yǎng)液游離DNA母源污染對推斷胚胎細胞染色體拷貝數(shù)的影響。結果顯示染色體拷貝數(shù)的性別不一致率和假陰性率均隨顆粒細胞、極體細胞和母源凈污染率的增加而增加。當凈母源污染比例高于60%時，性別不一致率和假陰性率分別增加到100%和75%。因此，當母源嚴重污染時，由SECM推斷的胚胎細胞的CNV就變得不準確。

圖5 胚胎培養(yǎng)液（SECM）中母源DNA污染和染色體拷貝數(shù)的整合分析。（A）scBS-seq推斷CNV；（B）母源污染對SECM推斷CNV的影響

綜上所述，該研究首次將胚胎培養(yǎng)液中游離DNA的細胞來源追溯到囊胚細胞、顆粒細胞和極體細胞，并且開發(fā)了快速便捷定量胚胎培養(yǎng)液游離DNA中母源污染量的算法，同時通過母源污染和染色體非整倍性的整合分析，提高了利用胚胎培養(yǎng)液檢測非整倍體胚胎的檢測效率。該研究對表征胚胎培養(yǎng)液中游離DNA提供了新見解，為無創(chuàng)植入前胚胎非整倍體遺傳學檢測（PGT-A）提供了新的視角。

北京大學前沿交叉學科研究院博士研究生陳依東和高原為該研究論文的共同第一作者。湯富酬、文路與北京大學第三醫(yī)院喬杰、黃錦為該論文的共同通訊作者。該研究項目得到了國家自然科學基金委和北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心的支持。

來源： 生物前沿創(chuàng)新中心