Toll/interleukin-1 receptor(TIR)結(jié)構(gòu)域是動物和植物免疫系統(tǒng)的經(jīng)典成份，可以識別入侵病原體的分子元件【1-2】。在人類中，Toll-like受體中的TIR結(jié)構(gòu)域通過蛋白-蛋白相互作用傳遞信號【1】；在植物中，含有TIR結(jié)構(gòu)域的免疫受體通過感知胞內(nèi)病原體，觸發(fā)TIR結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生一種環(huán)狀A(yù)DP-核糖變異分子（Variant of cyclic adenine diphosphate ribose, v-cADPR），最終造成細(xì)胞死亡（稱為超敏反應(yīng)），阻止病原體的繁殖和傳播【3-4】；TIR結(jié)構(gòu)域也被證明是真核細(xì)胞免疫系統(tǒng)Thoeris中的一個關(guān)鍵成份，可以保護(hù)細(xì)菌免受噬菌體感染【5】。Thoeris包含2個核心蛋白，其中的ThsB蛋白含有一個TIR結(jié)構(gòu)域。最近有研究發(fā)現(xiàn)Thoeris的另一個核心蛋白：non-TIR蛋白ThsA具有NADase活性，暗示Thoeris防御涉及NAD+水解，可能造成感染后細(xì)胞死亡【6】。目前關(guān)于植物TIR如何介導(dǎo)細(xì)胞死亡及細(xì)菌Thoeris系統(tǒng)的抗病毒分子機制均不清楚。
2021年12月1日，來自以色列魏茨曼科學(xué)研究所的Rotem Sorek團(tuán)隊與Gil Amitai團(tuán)隊合作在Nature雜志上在線發(fā)表了題為Antiviral activity of bacterial TIR domains via immune signalling molecules的研究論文，揭示了細(xì)菌中Thoeris免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗病毒信號通路，其在植物和細(xì)菌免疫中都是保守的。該研究還追蹤了細(xì)菌和真核生物的TIRs之間可能的功能和進(jìn)化聯(lián)系。
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許多細(xì)菌防御系統(tǒng)在噬菌體感染時通過觸發(fā)細(xì)胞死亡來保護(hù)細(xì)菌，這一過程被稱為頓挫感染（abortive infection, 病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，若細(xì)胞缺乏病毒增殖所需的酶、能量及必要的成分，則病毒不能合成自身成分；或雖合成部分或全部成分，但不能裝配和釋放出有感染性的病毒顆粒）【7】。作者發(fā)現(xiàn)Thoeris系統(tǒng)可以使被感染細(xì)胞在噬菌體子代成熟之前死亡（圖1c），說明其主要通過abortive infection實現(xiàn)抗病毒功能。Thoeris系統(tǒng)包含兩個基因：thsA和thsB，二者必須同時存在才能實現(xiàn)Thoeris的防御功能【5】。ThsB包含一個TIR結(jié)構(gòu)域，而ThsA N端有一個sirtuin（SIR2）結(jié)構(gòu)域（圖1a）。近期研究表明，ThsA中的SIR2結(jié)構(gòu)域具有催化NADase活性【6】。在其他噬菌體防御系統(tǒng)中，NAD+的缺失與abortive infection有關(guān)，同時有研究推測ThsA引起的NAD+缺失與Thoeris abortive infection有關(guān)。為了驗證這一觀點，作者采用LC-MS對噬菌體感染過程中的NAD+水平進(jìn)行了監(jiān)測。結(jié)果顯示，在SPO1噬菌體感染后60分鐘左右，僅在表達(dá)Thoeris的細(xì)胞中觀察到NAD+的完全缺失（圖1d），說明ThsA的NADase活性是導(dǎo)致NAD+耗竭的原因。
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圖1. Thoeris引起abortive infection和NAD+耗竭
作者推測，在響應(yīng)噬菌體感染時，Thoeris TIR蛋白可能會產(chǎn)生一種信號分子，類似于植物TIR生成的v-cADPR，這種信號分子可以觸發(fā)ThsA的NADase活性，隨后導(dǎo)致abortive infection。為了驗證這個假設(shè)，作者在B.subtilis細(xì)胞中只表達(dá)Thoeris ThB TIR蛋白，并用噬菌體SPO1對這些細(xì)胞進(jìn)行感染。如圖2a所示，在感染中的多個時間點裂解被感染的細(xì)胞，并過濾裂解液，使其只含有小于3KDa的分子，接著將純化后的ThsA蛋白與這些裂解液在體外進(jìn)行孵育，評估這些裂解液是否影響ThsA的NADase活性。結(jié)果顯示，當(dāng)與表達(dá)含有TIR的ThsB蛋白的被感染細(xì)胞裂解液共同孵育時，ThsA表現(xiàn)出顯著的NADase活性；與對照組細(xì)胞裂解液孵育時，ThsA的NADase活性并不會被觸發(fā)（圖2b），說明在噬菌體感染期間，Thoeris TIR蛋白產(chǎn)生了一種小分子具有激活ThsA的NADase活性的能力。為了進(jìn)一步探究細(xì)菌TIR產(chǎn)生的分子對ThsA的激活是否與植物TIRs產(chǎn)生的分子類似，作者在E.coli細(xì)胞中過表達(dá)了植物的含TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白BdTIR（其可以持續(xù)地產(chǎn)生v-cADPR），并獲取了其細(xì)胞裂解液。發(fā)現(xiàn)從表達(dá)BdTIR的E.coli中獲得的裂解液也可以觸發(fā)ThsA的NADase活性（圖2c），說明細(xì)菌Thoeris TIR和植物BdTIR在功能上相似，二者產(chǎn)生的第二信使均可以激活Thoeris效應(yīng)蛋白。
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圖2. ThsA的NADase活性由表達(dá)TIR的感染細(xì)胞產(chǎn)生的小分子觸發(fā)
為了進(jìn)一步揭示Thoeris TIR蛋白產(chǎn)生的信號分子的本質(zhì)，作者采用了非靶向LC-MS分析在SPO1噬菌體感染過程中表達(dá)Thoeris ThsB TIR蛋白的B.subtilis細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。在感染后45min的樣品中檢測到了一種獨特的分子，這種分子在未感染或感染后的早期時間點中檢測不到，說明這種分子是TIR蛋白在響應(yīng)噬菌體感染時產(chǎn)生的。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該分子的分子質(zhì)量接近于cADPR的分子質(zhì)量，但其在結(jié)構(gòu)上不同于經(jīng)典的cADPR，是一種cADPR異構(gòu)體。
ThsA除了N端的SIR2 NADase結(jié)構(gòu)域外，還有一個位于C端的SLOG結(jié)構(gòu)域。SLOG結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為可以結(jié)合核酸來源的信號分子（例如ADPR）。TRPM家族陽離子通道中含有SOLG同源結(jié)構(gòu)域，其可以被ADPR和它的衍生物觸發(fā)【8】。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)ThsA SLOG結(jié)構(gòu)域與TRPM2 SLOG結(jié)構(gòu)域的ADPR結(jié)合口袋區(qū)域在結(jié)構(gòu)上具有同源性，因此推測當(dāng)TIR產(chǎn)生的cADPR異構(gòu)體結(jié)合到ThsA C端SLOG結(jié)構(gòu)域時可以激活ThsA。作者將ThsA SLOG結(jié)構(gòu)域中的活性位點進(jìn)行突變后（R371A），Thoeris對噬菌體的防御能力喪失。接下來，作者檢測了野生型ThsA和突變體暴露在信號分子cADPR異構(gòu)體中的多聚狀態(tài)：在沒有信號分子時，大多數(shù)的ThsA蛋白以一種單體或四聚體的形式存在；當(dāng)存在信號分子時，大部分的ThsA蛋白轉(zhuǎn)變了它們的多聚狀態(tài)，主要以二聚體形式存在。因為暴露在信號分子下可以激活ThsA的NAD+降解活性，因此這些數(shù)據(jù)說明觀察到的多聚狀態(tài)的轉(zhuǎn)變反應(yīng)了ThsA酶的活化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ThsA R371A突變體在響應(yīng)信號分子時不能發(fā)生多聚狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。這些數(shù)據(jù)說明ThsA的SLOG結(jié)構(gòu)域驅(qū)動其多聚狀態(tài)變化，以響應(yīng)TIR衍生的cADPR異構(gòu)體信號，從而激活SIR2結(jié)構(gòu)域的NADase活性。
在自然的Thoeris系統(tǒng)中，thsA?SIR2結(jié)構(gòu)域基因通常伴有多個thsB?TIR結(jié)構(gòu)域基因。在同一位點的不同thsB基因之間往往存在差異，除了TIR結(jié)構(gòu)域及其保守活性位點的一般結(jié)構(gòu)外，通常很少有序列同一性。作者發(fā)現(xiàn)同一位點內(nèi)不同的ThsB蛋白負(fù)責(zé)識別不同的噬菌體相關(guān)分子模式，這與真核免疫系統(tǒng)中TIR結(jié)構(gòu)域蛋白的作用類似，說明Thoeris防御特異性取決于TIR結(jié)構(gòu)域蛋白的特性。
總的來說，該研究闡釋了Thoeris抗噬菌體防御系統(tǒng)的作用機制。如圖3所示，TIR結(jié)構(gòu)域蛋白ThsB負(fù)責(zé)識別噬菌體感染，一旦感染被檢測到，TIR結(jié)構(gòu)域就會變得具有酶活性，并催化cADPR異構(gòu)體分子的產(chǎn)生；這一分子反過來作為一種信號分子，通過與ThsA C端SLOG結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，改變ThsA的多聚體狀態(tài)激活ThsA的NADase活性，然后NADase效應(yīng)從細(xì)胞中耗盡NAD+，產(chǎn)生無法支持噬菌體復(fù)制的細(xì)胞條件并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該文章證實了TIR來源的cADPR異構(gòu)體可以作為免疫第二信使，同時對將來植物模型系統(tǒng)的研究提供指導(dǎo)信息，以揭示這種TIR產(chǎn)生的分子在植物對病原體的免疫反應(yīng)中的作用。該研究使得我們可以真正在機制上理解免疫系統(tǒng)，將有助于我們從容地面對新出現(xiàn)的病原體。
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圖3. Thoeris系統(tǒng)的作用機制模型

參考文獻(xiàn)

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來源： 北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心 ?