RNA編輯是近年來興起的基因編輯技術(shù)。2019年，北京大學(xué)魏文勝課題組在Nature Biotechnology雜志報導(dǎo)了新型RNA編輯技術(shù)LEAPER1。與以CRISPR為基礎(chǔ)的DNA或者RNA編輯技術(shù)不同，LEAPER僅需要在細(xì)胞中表達(dá)特殊設(shè)計的RNA（ADAR-recruiting RNA, arRNA）即可招募細(xì)胞中內(nèi)源脫氨酶ADAR，實(shí)現(xiàn)靶向目標(biāo)RNA中腺苷A→肌苷I（鳥苷G）的編輯。由于無需引入外源編輯酶或效應(yīng)蛋白，避免了由此引起的遞送以及相關(guān)的免疫原性等問題。另外作為RNA精準(zhǔn)編輯工具，LEAPER不會引起基因組序列改變，在安全性方面具有優(yōu)勢。盡管LEAPER在科研和疾病治療中具有可觀的潛力，該技術(shù)還存在一定的局限：一是LEAPER利用的是內(nèi)源編輯酶，其編輯效率會因此受限；另外，具有一定長度的arRNA可能使目標(biāo)編輯位點(diǎn)鄰近的堿基發(fā)生脫靶編輯，因此該技術(shù)亟需優(yōu)化升級。

2022年2月10日，魏文勝課題組在Nature Biotechnology雜志發(fā)表“Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo”的研究長文。該研究發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化表達(dá)載體中的啟動子增強(qiáng)arRNA表達(dá)可以顯著提升LEAPER系統(tǒng)的編輯效率，表明arRNA在細(xì)胞中的豐度對于編輯效率十分重要。然而線性arRNA在細(xì)胞內(nèi)容易被降解的特點(diǎn)成為了制約因素。為了克服這一問題，課題組通過設(shè)計并運(yùn)用可招募ADAR的環(huán)形RNA（circular ARAR-recruiting RNA,circ-arRNA），實(shí)現(xiàn)了編輯效率提升。

環(huán)形RNA沒有5’或3’末端，可以避免核酸外切酶的切割，在細(xì)胞內(nèi)相比于線性RNA具有更好的穩(wěn)定性和更長的半衰期。研究發(fā)現(xiàn)，circ-arRNA能夠維持較長時間的高水平表達(dá)。在多個內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本位點(diǎn)中，circ-arRNA平均編輯效率相比于線性版本提升了超過3倍，同時也可維持長達(dá)近半個月的有效編輯。通過腺相關(guān)病毒（AAV）遞送，遺傳編碼的circ-arRNA可以在人的原代細(xì)胞和類器官中實(shí)現(xiàn)長時程的RNA編輯。另外，體外合成的circ-arRNA也可實(shí)現(xiàn)高效的靶向編輯，并且與遺傳編碼的circ-arRNA具有類似的特征。

圖1 Circ-arRNA在內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本上實(shí)現(xiàn)高效、精準(zhǔn)的編輯

由于ADAR蛋白的底物為雙鏈RNA，靶向RNA與circ-arRNA形成的雙鏈區(qū)域內(nèi)的腺苷酸會有不同概率的脫氨風(fēng)險。消除這種鄰近堿基的脫靶編輯（bystander off-targetediting）是實(shí)現(xiàn)更加精準(zhǔn)的單堿基編輯的關(guān)鍵。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)刪除arRNA或circ-arRNA上非靶向腺苷酸對面的核苷酸后，可以有效避免非靶向腺苷酸的編輯。據(jù)此重新設(shè)計的circ-arRNA在內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本上基本消除了雙鏈RNA區(qū)域內(nèi)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上的脫靶，同時維持了較高的精準(zhǔn)靶向編輯效率。近期，Thorsten Stafforst課題組報道了名為CLUSTER的RNA編輯技術(shù)2，該技術(shù)雖然降低了鄰近堿基的脫靶編輯效率，但是其靶向編輯效率仍處于和線性arRNA類似的水平。與此相比，circ-arRNA不僅提升了RNA編輯效率，還消除了鄰近堿基的脫靶編輯，這一升級版技術(shù)被命名為LEAPER 2.0。

圖2 LEAPER2.0—通過工程化的circ-arRNA實(shí)現(xiàn)高效、精準(zhǔn)的RNA編輯

接下來對LEAPER 2.0應(yīng)用潛能的評估顯示，circ-arRNA可以成功激活Wnt信號通路，修復(fù)TP53基因中的致病突變使其表達(dá)的p53恢復(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。使用AAV將circ-arRNA遞送至Hurler綜合征疾病模型小鼠體內(nèi)，可以成功修復(fù)Idua致病突變并恢復(fù)IDUA的酶活。這些結(jié)果表明，LEAPER 2.0在科研和疾病治療中具有令人期待的優(yōu)勢與潛能。

魏文勝課題組博士研究生伊宗裔（CLS）、博士后璩良和博士研究生唐慧賢（BIOPIC）為該論文的共同第一作者。該研究項目得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目、北京市科委生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新推進(jìn)項目、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心以及中國博士后科學(xué)基金的支持。

來源：北京大學(xué)