蛋白質(zhì)作為承載生命活動的生物大分子以及生命體的重要組成部分，其功能取決于它們具有精確定義的結(jié)構(gòu)和動態(tài)特性復(fù)雜折疊的能力，在生物學(xué)各個領(lǐng)域中都被廣泛地研究。為便于理解蛋白質(zhì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，通常將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分成一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)這四個組織層次。其中，在蛋白質(zhì)折疊過程中，主鏈極性基團(tuán)與溶劑水之間或相互之間形成氫鍵，出現(xiàn)了由氫鍵穩(wěn)定的有規(guī)則的構(gòu)象，稱為二級結(jié)構(gòu) (Secondary structure)。二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因而被稱為構(gòu)象元件 (element)。
圖 1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的類型
α 螺旋 (α helix) 是蛋白質(zhì)中最常見、最典型和含量最豐富的二級結(jié)構(gòu)元件1。它是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基石、蛋白質(zhì)折疊研究的模型、蛋白質(zhì)設(shè)計的主力軍以及在蛋白質(zhì)工程和生物技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用2’3’4。此外，在蛋白質(zhì)中還存在幾種其他類型螺旋，包括 310 螺旋 (310-helices) 和 π 螺旋 (π-helices)5，但它們在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的出現(xiàn)頻率要低得多，不太有利的內(nèi)部能量和減少堆積成高級結(jié)構(gòu)的趨勢意味著天然蛋白質(zhì)中 310 螺旋的長度很少超過六個殘基，并且它們往往不會形成正常的超二級、三級或四級相互作用。
2022年6月22日，英國布里斯托大學(xué)的 Derek N. Woolfson 實驗室與Jonathan Clayden 實驗室合作，在 Nature 期刊上發(fā)表了題為 De novo design of discrete, stable 310-helix peptide assemblies的論文。論文迭代設(shè)計了穩(wěn)定的水溶性 310 螺旋束，揭示了 α 螺旋和 310 螺旋折疊之間的臨界點，并確定了穩(wěn)定 310 螺旋組件所需的特征，為設(shè)計進(jìn)入這個迄今為止尚未探索的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)空間區(qū)域提供了理論基礎(chǔ)。
為什么α 螺旋比許多其他的構(gòu)象更容易形成呢？一部分原因是因為它能最大程度地利用內(nèi)部氫鍵。從 N 端出發(fā)，α 螺旋的氫鍵是由每個肽基的 C=O 與 C 端的第4個肽基的 N-H 之間形成的 (COi?→?NHi+4)。每一連續(xù)的α 螺旋圈都由3到4個氫鍵固定住相鄰的螺圈，這樣給予整個螺旋結(jié)構(gòu)以很大的穩(wěn)定性。相比之下，310 螺旋和 π 螺旋具有不同的螺旋參數(shù)，分別以 COi?→?NHi+3和 COi?→?NHi+5 的模式形成氫鍵，導(dǎo)致更緊密和更松散的螺旋結(jié)構(gòu)。由于這兩種螺旋中的氫鍵幾何結(jié)構(gòu)及非鍵合相互作用并不處于最佳狀態(tài)，因此在熱力學(xué)上不太穩(wěn)定。因此，這些螺旋構(gòu)象在天然蛋白質(zhì)中較少出現(xiàn)并不意外。
研究者們調(diào)查已有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，310 螺旋和 π 螺旋的出現(xiàn)概率比 α螺旋少得多，且長度也短得多。此外，研究者們還發(fā)現(xiàn)幾乎沒有 310 螺旋和 π 螺旋通過超二級、三級或四級相互作用整合形成蛋白質(zhì)。顯然，這就引發(fā)出了兩個問題：（1）自然界中是否仍然存在由 310 螺旋或 π 螺旋組裝形成的蛋白質(zhì)？（2）研究者們能否制造出這類蛋白質(zhì)呢？
圖 2 分析 310 螺旋的 PDB 和設(shè)計原則
一些天然肽內(nèi)確實包含 310 螺旋構(gòu)象的區(qū)域，但其疏水性會降低肽在水中的溶解度。因此，研究者們大膽地推測，如果能從頭設(shè)計一個合成序列，形成一個足夠長度的兩親性 310 螺旋——即具有明顯疏水面和極性面，它可以通過螺旋-螺旋相互作用來穩(wěn)定以形成一個 310 螺旋束。
結(jié)合生物信息學(xué)，研究者們發(fā)現(xiàn)，對于 ≥ 6 個殘基的 310 螺旋，對 310 螺旋二級結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)偏好性的殘基包括谷氨酸 (Glu, E)、賴氨酸 (Lys, K)、亮氨酸 (Leu, L) 和色氨酸 (Trp , W)?；诖?，研究者設(shè)計了七個殘基序列 E-L-A-A-L-K-X（其中 X 可以是任何氨基酸），將序列重復(fù)四次以制備肽 PK-1。
接下來，通過圓二色譜 (CD) 和分析型超速離心技術(shù) (AUC)，研究者發(fā)現(xiàn) PK-1 采用 α 螺旋形成了三聚體物質(zhì)，并通過 X 射線晶體衍射確定了這種結(jié)構(gòu)。由于 α-氨基異丁酸 (Aib, U) 殘基能穩(wěn)定 310 螺旋構(gòu)象，研究者替換了 PK-1 中的 Ala 殘基以得到 PK-2。然而，與 PK-1 一樣，PK-2 在溶液中仍然是高度 α 螺旋、熱穩(wěn)定和單分散的三聚體。研究者們進(jìn)一步推測，鏈間鹽橋可能會穩(wěn)定此類螺旋束，從而設(shè)計了兩種肽 PK-3 和 PK-4，包含四次重復(fù)的六個殘基序列 E-L-Z-Z-L-K（其中 Z? 分別表示 Ala 和 Aib 殘基）。
實驗驚奇地發(fā)現(xiàn)，PK-4 的 CD 光譜明顯不同于之前的三種肽，且 AUC測量表明 PK-4 可以與單分散六聚體結(jié)合，形成有中心腔的桶，并具有堅固的疏水核心的緊密堆積結(jié)構(gòu)。
為了更直觀地觀察 PK-4 的形態(tài)，研究者嘗試通過結(jié)晶解析 PK-4 及其衍生物的 X 射線結(jié)構(gòu)。最終，研究者解析了變體 PK-5 （D-Glu，D-Lys和D-Leu以及C端D-Br-Phe 突變）的2.34 ? 晶體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)揭示了八個 310左手螺旋的平行束，值得注意的是，PK-5 的螺旋每轉(zhuǎn)具有約 3.15 個殘基，以及 COi?→?NHi+3 氫鍵的九個連續(xù)轉(zhuǎn)角（27 個殘基）。天然蛋白質(zhì)中罕見的長 310 螺旋的例子往往是不規(guī)則的，相比之下，PK-5 的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)中曲線更平滑。更詳細(xì)地說，PK-5 的結(jié)構(gòu)具有 C4 對稱性，其中成對的相鄰螺旋有助于形成內(nèi)部四螺旋束和外部四螺旋環(huán)。側(cè)鏈的填充是緊密的，讓人想起 α 螺旋盤繞線圈中的“旋鈕入孔”填充。與親本 PK-4 相比，PK-5 采用 p-Br-Phe 代替了 Trp。PK-5 的擴(kuò)展晶格揭示了八聚體的并排和頭對尾堆積，其中 D-p-Br-Phe 殘基堆積在一層中并與許多邊對面的芳香族相互作用。將 D-Trp 殘基建模到這些位點揭示了八聚體之間潛在的空間沖突，這可能部分解釋了為什么 PK-4 沒有結(jié)晶。因此，組裝編程到兩親性 310 螺旋序列中的強(qiáng)大趨勢可以通過序列中的細(xì)微之處進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致不同程度的寡聚化。
圖 4 從頭設(shè)計的肽的晶體結(jié)構(gòu)
PK-4 和 PK-5 分別形成六個和八個 310 螺旋的平行束，這種組裝在所涉及的 310 螺旋的長度以及此類螺旋的水溶性、超分子或四元組裝方面都是前所未有的。隨著設(shè)計目標(biāo)實現(xiàn)，研究者們將 PK-4 和 PK-5 分別重命名為 310HD 和 D-310HD。這便引發(fā)了進(jìn)一步的問題，即為什么在天然蛋白質(zhì)中沒有發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)構(gòu)，以及研究者從頭設(shè)計的序列哪些特征使其如此易于形成穩(wěn)定的基于 310 螺旋的四元結(jié)構(gòu)？為了解決這些問題，研究者設(shè)計一系列的 310HD 的變體。
首先，研究者測試了六個殘基重復(fù)序列的“亮氨酸位點”的疏水性和空間大小對 310HD 折疊和組裝的影響。分別采用 Ala (PK-6)、Aib (PK-7)、Ile (PK-8) 和Val (PK-9) 替換 310HD 的所有 Leu 殘基。最終證實，在蛋白質(zhì)脂肪族疏水側(cè)鏈中，Leu 最能促進(jìn) 310 螺旋的超分子組裝和穩(wěn)定。
接下來，研究者測試了改變肽長度對 310 螺旋束穩(wěn)定性的影響。保留整個序列重復(fù) ELUULK，但系統(tǒng)地將序列重復(fù)的數(shù)量從四個減少到三個 (PK-12)和兩個 (PK-10)。最短的肽 PK-10 在溶劑中是部分折疊的單體，有趣的是，PK-12 的 CD 光譜揭示了從部分 α 螺旋到 310 螺旋構(gòu)象的協(xié)同濃度依賴性轉(zhuǎn)換：隨著肽濃度的增加，肽的寡聚狀態(tài)從多個低聚體變?yōu)楦邼舛鹊牧垠w。PK-4 (310HD) 系列?→?PK-12?→?PK-10 表明肽長度以及疏水接縫的長度對于 310 螺旋的折疊、組裝和穩(wěn)定至關(guān)重要。
最后，利用 D-310HD 結(jié)構(gòu)的對稱性和鹽橋，研究者設(shè)計了一個包含酸性(PK-13) 和堿性 (PK-14) 肽的異聚系統(tǒng)。當(dāng)二者在溶液中分離時，兩種肽各自折疊形成 α 螺旋單體。然而當(dāng)混合時，二者則形成 310 螺旋，形成與 310HD 相似的單分散六聚體。
總的來說，本項研究首次實現(xiàn)了由 310螺旋肽構(gòu)建的水溶性超分子組裝體或四元結(jié)構(gòu)的合理從頭設(shè)計。這些設(shè)計包含：（1）生物信息引導(dǎo)的簡化氨基酸字母表；（2）非蛋白原α, α-二取代氨基酸Aib；（3）嚴(yán)格的六殘基序列重復(fù)；和（4）至少三個序列重復(fù)。除了第二個特征之外的所有特征都可以通過天然核糖體蛋白質(zhì)合成來實現(xiàn)，這就提出了為什么大自然沒有發(fā)現(xiàn)和利用這些或類似結(jié)構(gòu)的問題。盡管如此，研究者們?nèi)匀惶峁┝藳Q定性的證據(jù)，證實人工設(shè)計能實現(xiàn)穩(wěn)定的 310 螺旋構(gòu)象和組件。在未來的研究中，此項工作為天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)空間區(qū)域的新結(jié)構(gòu)和功能肽化學(xué)探索開辟了新的途徑。
https://www.nature.com/articles/s41586
-022-04868-x#Sec5
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