上海藥物所發(fā)現(xiàn)33肽標(biāo)簽提高大腸桿菌表達單鏈抗體溶解度和穩(wěn)定性

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單鏈抗體（single chain variable fragment，scFv）由抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)通過一段柔性多肽連接而成。scFv分子量僅約30 kDa，具有較高的組織穿透能力，在體內(nèi)比抗體更快被清除。scFv可避免由Fc區(qū)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。這些特征使scFv更適合應(yīng)用在體內(nèi)影像診斷、腫瘤和細(xì)胞內(nèi)病原體的靶向治療等領(lǐng)域。由于固有的低溶解度和穩(wěn)定性，只有兩種大腸桿菌生產(chǎn)的scFv已被批準(zhǔn)用于治療。因此，亟需相關(guān)手段提高大腸桿菌表達的scFv溶解度和穩(wěn)定性，為scFv的生產(chǎn)、研究和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

　　8月8日，中國科學(xué)院上海藥物研究所新藥研究國家重點實驗室羅成課題組副研究員陳示潔與復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院重點實驗室副研究員王勇翔合作，在大腸桿菌表達的單鏈抗體溶解度和穩(wěn)定性領(lǐng)域取得進展。相關(guān)研究成果以A 33-residue peptide tag increases solubility and stability of Escherichia coli produced single-chain antibody fragments為題，在線發(fā)表在《自然-通訊》（Nature Communications）上。

　　scFv的重鏈和輕鏈可變區(qū)的鏈內(nèi)二硫鍵對于其穩(wěn)定性至關(guān)重要。普通大腸桿菌細(xì)胞漿缺少催化二硫鍵形成的組分，且具有谷胱甘肽還原酶和硫氧還蛋白還原酶還原二硫鍵，因而多數(shù)在普通大腸桿菌細(xì)胞漿表達的scFv均呈不溶性的包涵體。一些具有促溶活性的蛋白標(biāo)簽如MBP、GST、NusA和Trx等，能夠進一步提高它們的溶解度。然而，如MBP之類的促溶標(biāo)簽蛋白因體積龐大而形成空間位阻干擾scFv與抗原結(jié)合，故必需通過蛋白酶切去除；而去除促溶標(biāo)簽蛋白會使scFv不穩(wěn)定，誘導(dǎo)產(chǎn)生無活性的聚集體。

　　來自T7噬菌體尾部的P17蛋白，通過一段由33個氨基酸組成的多肽（稱P17多肽或標(biāo)簽）與肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）特異性結(jié)合將噬菌體顆粒和小分子、蛋白、核酸以及脂質(zhì)體等靶向運送到肝細(xì)胞。研究選擇能夠靶向乙肝病毒包膜蛋白的G12-scFv作為研究對象，為了提高G12-scFv被肝細(xì)胞內(nèi)吞的效率，將P17標(biāo)簽融合在其羧基末端。在大腸桿菌SHuffle菌株表達時，G12-scFv-P17蛋白的溶解度顯著高于G12-scFv蛋白。半定量溶解度測定實驗發(fā)現(xiàn)，P17標(biāo)簽?zāi)苡行У靥岣咂渌?種不同scFv在SHuffle菌株中的溶解度，且P17標(biāo)簽對scFv的促溶效應(yīng)與它在氨基和羧基末端的位置無關(guān)。缺失突變和點突變分析發(fā)現(xiàn)，P17標(biāo)簽對scFv的促溶效應(yīng)與它的親水序列尤其是帶電氨基酸殘基相關(guān)，而與可能存在的α螺旋二級結(jié)構(gòu)無關(guān)。

　　熱穩(wěn)定性實驗表明，P17標(biāo)簽和鏈內(nèi)二硫鍵一樣提高scFv的熱穩(wěn)定性。P17標(biāo)簽融合的G12-scFv與抗原的結(jié)合能力以及它的病毒中和活性提高了超過兩倍，這提示P17標(biāo)簽具有I型分子內(nèi)伴侶樣的活性。該研究發(fā)現(xiàn)33肽標(biāo)簽?zāi)軌蝻@著提高單鏈抗體在大腸桿菌Shuffle細(xì)胞中的溶解度和穩(wěn)定性，為單鏈抗體的生產(chǎn)、研究和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

　　研究工作得到國家自然科學(xué)基金和上海市科學(xué)技術(shù)委員會等的支持，并獲得德國弗賴堡大學(xué)等的科研人員的協(xié)助。

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