基于CRISPR-Cas9的引導編輯器（prime editors，PEs）可同時實現(xiàn)任意堿基類型的精準替換，以及小片段的精準插入、替換和刪除。目前，幾乎所有的引導編輯器均是依賴于Cas9蛋白開發(fā)而成，但Cas9蛋白存在尺寸較大、脫靶效應高和受限于G/C-rich區(qū)域編輯的缺點，限制了引導編輯器的廣泛應用。如何進一步提升引導編輯器的編輯精度、消除靶點序列限制并降低遞送難度是基因組編輯領域亟待解決的重要技術難題。

與Cas9蛋白相比：Cas12a蛋白及其crRNA分子量均較小，易于遞送；Cas12a具有更低的脫靶效應，適合疾病治療；Cas12a蛋白識別基因組A/T-rich區(qū)域，能夠編輯Cas9蛋白無法編輯的位點。因此，基于Cas12a開發(fā)的引導編輯器將在基因治療和農業(yè)生產(chǎn)方面頗具應用潛力。研究表明，Cas12a蛋白具有切割pegRNA（prime editing guide RNA）的特點，故傳統(tǒng)的pegRNA不適用于Cas12a引導編輯器的開發(fā)。利用Cas12a蛋白的不同形式，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究團隊開發(fā)了適合不同場景的基于環(huán)狀RNA的引導編輯系統(tǒng)CPEs（circular RNA-mediated prime editors）：基于切口酶的引導編輯器niCPE（nickase-dependent CPE，圖a）；基于雙鏈核酸酶的引導編輯器nuCPE（nuclease-dependent CPE，圖b）；可拆分niCPE的引導編輯器sniCPE（split nickase-dependent CPE，圖c）；可拆分nuCPE的引導編輯器snuCPE（split nuclease-dependent CPE，圖d）。niCPE和nuCPE在人類細胞系HEK293T中效率分別高達24.89%和10.42%，適合慢病毒等大分子量遞送系統(tǒng)。sniCPE和snuCPE在HEK293T細胞中效率分別高達40.75%和3.19%，適合AAV遞送。除了HEK293T細胞以外，niCPE和sniCPE在HeLa、N2A、MCF7等細胞中也能夠有效產(chǎn)生精確的引導編輯（圖e-f）。

該研究把靶向多個位點的多個crRNA串聯(lián)在一起，置于環(huán)狀RNA的表達框中，并把靶向多個位點的RTT-PBS序列也串聯(lián)在環(huán)狀RNA表達框中。實驗結果表明，這樣的設計可以高效實現(xiàn)雙基因、三基因甚至四基因的引導編輯。研究進一步檢測了CPE引導編輯器的脫靶效應。結果表明，CPE具有優(yōu)良的特異性，幾乎沒有檢測到脫靶效應。低脫靶效應、高編輯效率的CPE系統(tǒng)為利用各種核酸酶開發(fā)為新型引導編輯系統(tǒng)提供了通用范式。多類型的CPE系統(tǒng)將在生物研究、疾病治療和作物育種等場景中發(fā)揮潛力。

1月10日，相關研究成果以Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells為題，在線發(fā)表在《自然-生物技術》（Nature Biotechnology，DOI：10.1038/s41587-023-02095-x）上。研究工作得到科技創(chuàng)新2030-農業(yè)生物育種重大項目和國家重點研發(fā)計劃等的支持。

基于環(huán)狀RNA開發(fā)的CRISPR-Cas12a引導編輯系統(tǒng)

來源：中科院