北京時(shí)間2024年11月1日，《科學(xué)進(jìn)展》（Science Advances）以長文（Research Article）形式在線發(fā)表了武漢大學(xué)團(tuán)隊(duì)和中國科學(xué)院上海有機(jī)所交叉中心團(tuán)隊(duì)的最新研究成果。

研究人員首次在原子水平上解析了銅鋅超氧化物歧化酶（SOD1）病理突變體H46R和G85R淀粉樣纖維的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（3.11 ?和2.97 ?），揭示了H46R和G85R淀粉樣纖維對(duì)神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡激活調(diào)控，并誘發(fā)家族遺傳型萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）新機(jī)制，為發(fā)展新的針對(duì)SOD1突變體纖維的ALS治療藥物奠定了基礎(chǔ)。

武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院梁毅教授和中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所交叉中心劉聰研究員為該論文的共同通訊作者；武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后王利強(qiáng)、中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所交叉中心博士生馬燁陽和武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生張沐雅為共同第一作者；武漢大學(xué)土木建筑工程學(xué)院王正直教授、深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄒良玉教授等參與了該論文的研究工作，武漢大學(xué)科研公共服務(wù)條件平臺(tái)冷凍電鏡機(jī)組特聘高級(jí)工程師李丹陽和實(shí)驗(yàn)員李香凝在數(shù)據(jù)收集工作中提供了重要協(xié)助。

ALS又稱漸凍癥或漸凍人癥，是一種進(jìn)行性的、致命的神經(jīng)退行性疾病。SOD1病理突變體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形成纖維樣聚集體是ALS的重要病理特征之一。SOD1編碼基因sod1是最早被發(fā)現(xiàn)的同時(shí)又是第二常見的與ALS有關(guān)的基因，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)引起家族遺傳性ALS的SOD1突變體多達(dá)208種，然而，這些SOD1突變體誘發(fā)家族遺傳型ALS的分子機(jī)制仍不清楚。

在對(duì)ALS患者的中央神經(jīng)系統(tǒng)的解剖中科學(xué)家曾多次鑒定到SOD1的錯(cuò)誤構(gòu)象和聚集物，從SOD1突變的ALS轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中也可分離得到SOD1的纖維樣聚集體，然而盡管大量證據(jù)顯示了SOD1異常聚集與神經(jīng)退行性疾病發(fā)生間存在密切關(guān)聯(lián)，目前的研究仍不能確切闡釋SOD1聚集在ALS的病理損傷中究竟發(fā)揮著怎樣的效應(yīng)，又是通過什么機(jī)制形成并影響著發(fā)病進(jìn)程。很多SOD1病理突變體仍然保持著近似野生型SOD1的酶活性，這意味著酶活性的喪失并非是SOD1產(chǎn)生神經(jīng)毒性的主要原因，SOD1很可能通過形成異常構(gòu)象或聚集獲得了毒性，而突變則加劇了蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊和異常聚集的傾向。

圖1：SOD1病理突變體H46R和G85R的纖維結(jié)構(gòu)具有相似的僅由C端片段組成的纖維核心，與在N端和C端間形成了穩(wěn)定鹽橋作用的野生型纖維結(jié)構(gòu)大不相同

在野生型朊蛋白及其病理突變體E196K淀粉樣纖維和野生型銅鋅超氧化物歧化酶（SOD1）淀粉樣纖維冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及功能前期工作（2020年6月8日、2021年9月9日、2022年6月17日和2023年12月8日分別發(fā)表于《自然?結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)》（Nat. Struct. Mol. Biol. 2020, 27, 598-602）、《科學(xué)進(jìn)展》（Sci. Adv. 2021, 7, eabg9676）、《自然—通訊》（Nat. Commun. 2022, 13, 3491）和《自然—通訊》（Nat. Commun. 2023, 14, 8131））中，梁毅與劉聰團(tuán)隊(duì)合作解析了全長野生型朊病毒蛋白纖維、全長E196K纖維和類朊病毒蛋白野生型SOD1纖維的結(jié)構(gòu)，首次在原子水平上揭示了朊蛋白由細(xì)胞型朊蛋白（PrP^C）向病理型朊病毒蛋白（PrP^Sc）結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的機(jī)制，揭示了朊病毒蛋白病理聚集多態(tài)性的分子機(jī)制，揭示了ALS致病蛋白質(zhì)SOD1構(gòu)象轉(zhuǎn)化分子機(jī)制，揭示了miRNA對(duì)PrP^C相分離、肌肉細(xì)胞自噬及分化調(diào)控機(jī)制。H46R和G85R是兩種顯著影響金屬離子結(jié)合的病理突變體，然而SOD1病理突變體到底是怎么激活調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡并誘發(fā)家族遺傳型ALS的仍是困擾科學(xué)界的謎題。

“冷凍電鏡（Cryo-EM）技術(shù)為蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊與神經(jīng)退行性疾病帶來革命性的進(jìn)展；解析SOD1病理突變體纖維的高分辨率結(jié)構(gòu)將為闡釋ALS發(fā)病的分子機(jī)制起到極大的推動(dòng)。”論文指出。

圖2：SOD1病理突變體H46R和G85R的纖維種子顯著激活受GPX4調(diào)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡

梁毅介紹，為了回答“SOD1突變到底是怎么誘發(fā)家族遺傳型ALS的”這一科學(xué)問題，在這項(xiàng)研究中，研究人員通過激光共聚焦顯微和免疫印跡等方法發(fā)現(xiàn)，與野生型SOD1纖維相比，這些突變體纖維具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源SOD1聚集和線粒體功能紊亂的能力，顯著激活受谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）調(diào)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡。GPX家族是在細(xì)胞氧化還原通路中位于SOD家族下游的過氧化物酶，GPX4可以清除膜脂過氧化氫產(chǎn)物，更是一種鐵死亡的重要抑制因子，近年來被用作判斷細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的關(guān)鍵指標(biāo)。該研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，這些突變體纖維種子可能通過誘導(dǎo)聚集效應(yīng)觸發(fā)一系列復(fù)雜的氧化損傷通路，乃至激發(fā)了鐵死亡途徑，最終誘發(fā)家族遺傳型ALS。

通過進(jìn)一步研究，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，這兩種顯著影響金屬離子結(jié)合的病理突變體H46R和G85R的纖維結(jié)構(gòu)具有相似的僅由C端片段組成的纖維核心，與在N端和C端間形成了穩(wěn)定鹽橋作用的野生型纖維結(jié)構(gòu)大不相同，異硫氰酸胍解聚實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這兩種突變體纖維的穩(wěn)定性相比野生型顯著降低。在G85R聚集過程中，單股原纖維通過病理突變位點(diǎn)的Arg85和Asp101之間形成的鹽橋發(fā)生相互作用，形成一個(gè)親水空腔，而在H46R聚集過程中，單股原纖維則通過Asn86和Asp101之間形成的氫鍵發(fā)生相互作用，形成一個(gè)親水空腔。此前研究表明，SOD1氨基酸位點(diǎn)突變會(huì)帶來的自由能形貌變化和活化構(gòu)象擾動(dòng)，那么該工作解析到的不同突變體生長纖維的結(jié)構(gòu)多樣性或許是一系列物理化學(xué)性質(zhì)變化的下游事件。

在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中，H46R、G85R的纖維種子表現(xiàn)出比野生型種子更強(qiáng)的細(xì)胞毒性并造成了更顯著的線粒體損傷，用野生型SOD1、H46R或G85R纖維的種子處理穩(wěn)轉(zhuǎn)FLAG-野生型SOD1的HEK-293T細(xì)胞均可以誘導(dǎo)內(nèi)源過表達(dá)SOD1的共聚集，并從細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到FLAG陽性Sarkosyl不溶性沉淀，但兩種突變體纖維的誘導(dǎo)聚集能力明顯強(qiáng)于野生型。

這項(xiàng)工作的研究結(jié)果表明，H46R和G85R纖維核心分別由其C端的85-153和82-153組成，H46R和G85R纖維都由單股原纖維以左手螺旋的方式纏繞而成，纖維核心的部分疏水氨基酸側(cè)鏈向內(nèi)折疊形成1個(gè)長的疏水空腔，起到了穩(wěn)定淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)的作用。這兩種病理突變使得SOD1喪失了大部分結(jié)合銅離子和鋅離子的能力，導(dǎo)致SOD1纖維的結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，H46R和G85R纖維核心的部分親水氨基酸側(cè)鏈向內(nèi)折疊形成3個(gè)親水空腔，使得這些突變體纖維相較野生型纖維具有更不穩(wěn)定的構(gòu)象。

圖3：SOD1病理突變體H46R和G85R的纖維種子具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源SOD1聚集（“模板折疊”）的能力

該研究首次揭示了H46R纖維、G85R纖維和野生型SOD1纖維之間的結(jié)構(gòu)差異，在原子水平上揭示了SOD1病理突變體H46R和G85R淀粉樣纖維激活細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制，證明金屬離子結(jié)合區(qū)域的兩種病理突變都能夠破壞SOD1纖維中重要的相互作用（例如鹽橋），使得這些病理突變體纖維結(jié)構(gòu)形成了彼此類似但又完全不同于野生型SOD1纖維的構(gòu)象，突顯了具有相似功能的SOD1病理突變體可能表現(xiàn)出相似的纖維結(jié)構(gòu)的重要性，并使得發(fā)展新的針對(duì)SOD1突變體纖維及其激活的鐵死亡的ALS治療藥物成為可能。

相關(guān)論文信息：DOI: https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado8499

來源：科學(xué)網(wǎng)