2024年11月22日，北京大學生命科學學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、核糖核酸北京研究中心高寧課題組在The EMBO Journal發(fā)表了題為“Structural insight into Okazaki fragment maturation mediated by PCNA-bound FEN1 and RNaseH2”的研究論文，對含有PCNA的內(nèi)源相關(guān)復合物進行結(jié)構(gòu)研究，獲得了兩組PCNA復合物（PCNA-FEN1、PCNA-FEN1-RNaseH2）的結(jié)構(gòu)，為理解岡崎片段成熟的后期步驟提供了一系列的結(jié)構(gòu)快照。

論文截圖

真核生物DNA復制在復雜的染色質(zhì)環(huán)境下進行，與多種分子生物學過程互相協(xié)調(diào)，例如DNA復制與修復的偶聯(lián)以及DNA復制與新生核小體組裝的偶聯(lián)等^1,2。PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）作為DNA復制體不可缺少的輔助蛋白，在DNA復制中結(jié)合各種DNA聚合酶以賦予其持續(xù)合成的能力，也可以將多種因子募集到DNA復制、修復等DNA代謝事件發(fā)生的位點，并促進相應的生物學反應，是DNA代謝的中心樞紐之一^3,4。與PCNA相互作用的蛋白超過兩百多種，包括DNA復制相關(guān)蛋白（Pol δ、Pol ε、Pol η、Pol κ、FEN1、LIG1等）、解旋酶（WRN、BLM、RECQ5等）、DNA修復蛋白（MSH3、MSH6、XPG、FANCM等）、表觀遺傳因子（CAF-1、DNMT1、p300、HDAC1等）及參與細胞周期調(diào)控、凋亡等過程的一些蛋白分子，它們都是通過自身保守的PIP box（PCNA-interacting protein box）或PIP-like基序結(jié)合PCNA⁴。

真核生物PCNA是環(huán)繞雙鏈DNA的同源三聚體，每個單體都包含一個PIP box結(jié)合位點，因此一個PCNA環(huán)可以至多結(jié)合3個含有PIP box的蛋白因子。領(lǐng)域內(nèi)認為PCNA的協(xié)調(diào)功能是通過“工具帶，toolbelt”的形式實現(xiàn)，即PCNA同時結(jié)合處于上下游過程的不同的酶，以提高DNA代謝相關(guān)事件的整體效率⁴。一個具有代表性的例子是DNA復制過程中的滯后鏈岡崎片段的加工成熟，參與這一過程的所有具有催化活性的酶都與PCNA有相互作用，包括Pol δ、RNaseH2、FEN1、EXO1、PIF1、DNA2以及LIG1^4—6。參與引物去除的主要因子是Pol δ、RNaseH2和FEN1，RNaseH2作為RNA核酸酶去除由Pol α與引物酶復合物所合成的RNA-DNA引物中的RNA；DNA聚合酶Pol δ在完成滯后鏈上的新生DNA鏈的延伸之后，會進行鏈置換反應，繼續(xù)向前合成將臨近岡崎片段中的引物頂起，形成5′-flap DNA結(jié)構(gòu)；FEN1作為結(jié)構(gòu)特異性的DNA核酸內(nèi)切酶結(jié)合并切割5′-flap DNA；通過這一系列步驟，保真度較差的DNA引物及RNA引物得以去除。領(lǐng)域前期通過體外重組的方式，已經(jīng)獲得了PCNA-FEN1-Pol δ、PCNA-FEN1-LIG1復合物，對它們的結(jié)構(gòu)和功能進行了表征，部分地驗證了PCNA作為工具帶的分子角色^7,8。然而很多重要的機制性的問題還未得到解答，例如PCNA如何特異性地選擇并協(xié)調(diào)參與同一DNA代謝事件的不同蛋白因子；同時結(jié)合在PCNA上的蛋白因子之間是否進行相互的變構(gòu)調(diào)節(jié)等。

課題組以PCNA作為誘餌蛋白，首先建立了一套從染色質(zhì)中快速純化PCNA內(nèi)源復合物的方法，得到了一系列含有PCNA且參與DNA復制、核小體組裝、DNA修復等過程的內(nèi)源復合物。

圖1 PCNA內(nèi)源相關(guān)復合物的獲得

課題組結(jié)合冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)技術(shù)解析了兩套復合物PCNA-FEN1與PCNA-FEN1-RNaseH2不同狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)。其中PCNA-FEN1復合物中FEN1處于催化后狀態(tài)，5′-flap DNA被切割但尚未離開FEN1的酶活中心，表明FEN1的5′-flap DNA產(chǎn)物釋放在細胞內(nèi)是限速步驟。

圖2 PCNA-FEN1復合物中5′-flap DNA已被酶切

該研究在PCNA-FEN1-RNaseH2復合物中，發(fā)現(xiàn)FEN1與RNaseH2分別結(jié)合PCNA的不同亞基，證實了PCNA工具帶的功能。對不同狀態(tài)的PCNA-FEN1-RNaseH2復合物進行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)RNaseH2始終結(jié)合在FEN1催化位點上游固定的雙鏈DNA區(qū)域，并且此區(qū)域不包含任何未去除的RNA殘基，這表明同時結(jié)合PCNA的FEN1與RNaseH2存在一種未被認識到的功能上的耦合。因為5′-flap DNA是聚合酶Pol δ繼續(xù)向前合成進行鏈置換的產(chǎn)物，其核苷酸序列與其上游雙鏈DNA序列一致，所以在細胞中5′-flap DNA很可能侵入上游的雙鏈DNA，產(chǎn)生3′-flap DNA，一旦3′-flap長度大于1nt，F(xiàn)EN1將無法切割5′-flap DNA。然而，當RNaseH2結(jié)合在5′-flap DNA上游雙鏈DNA時，由于空間位阻的存在，5′-flap DNA無法進行鏈入侵，大幅降低了5′-flap DNA轉(zhuǎn)化形成3′-flap DNA的概率，因此RNaseH2可能通過維持DNA底物的特定構(gòu)象以促進FEN1 5′-flap DNA的酶切效率。

圖3 人源PCNA-FEN1-RNase H2復合物結(jié)構(gòu)

此外，結(jié)構(gòu)分析表明在PCNA-FEN1-RNaseH2復合物中RNaseH2蛋白通過RNaseH2A亞基結(jié)合PCNA，而不是之前報道的RNaseH2B PIP box結(jié)合PCNA，序列分析鑒定到RNaseH2A亞基中一個新的PIP box，通過體外生化實驗驗證了RNaseH2A及RNaseH2B亞基的PIP box都可以結(jié)合PCNA。結(jié)合免疫熒光電鏡的成像實驗，表明RNaseH2A PIP box與RNaseH2B PIP box在不同的生理學過程中發(fā)揮功能。

本研究表明PCNA在細胞內(nèi)可以作為工具帶同時結(jié)合多個蛋白因子。之前的模型認為同時結(jié)合PCNA的蛋白是按照順序發(fā)揮功能，一個酶發(fā)揮完功能后與DNA解離，釋放出DNA底物以供另一個酶結(jié)合；與之前的模型不同，在PCNA-FEN1-RNaseH2復合物結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)EN1與RNaseH2穩(wěn)定結(jié)合同一個DNA底物，RNaseH2可能通過對底物DNA的構(gòu)象調(diào)控來促進FEN1的酶切效率。這表明細胞內(nèi)同時結(jié)合PCNA的不同蛋白因子間可能會對它們酶促反應動力學進行互相調(diào)控。RNaseH2除了作為RNA核酸酶參與岡崎片段引物RNA的去除外，本研究發(fā)現(xiàn)了RNaseH2的另一個可能的新功能，即以不依賴于核酸酶活性的形式作為雙鏈DNA結(jié)合蛋白來調(diào)節(jié)FEN1的5′-flap DNA酶切功能。

圖4 RNaseH2在岡崎片段成熟過程中發(fā)揮作用的模型

高寧為本論文的通訊作者。生命科學學院2020級博士研究生田宇輝為本論文第一作者。生命科學學院研究員李寧寧在實驗方法探究及結(jié)構(gòu)計算方面提供了幫助。生命科學學院教授李晴為該論文提供了支持與幫助。本研究得到了國家自然科學基金和昌平實驗室的支持。北京大學冷凍電鏡平臺、昌平實驗室冷凍電鏡平臺、北京大學高性能計算平臺、生命科學學院儀器中心及國家蛋白質(zhì)基礎(chǔ)設(shè)施（北大分平臺）對本項目提供了重要的技術(shù)支持。

參考文獻：

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來源：北京大學