文|吳思涵

前言

DNA存在于真核細(xì)胞的哪些位置呢？如果你學(xué)習(xí)過高中生物，應(yīng)該可以很輕松地回答：細(xì)胞核、線粒體、葉綠體。

絕大多數(shù)DNA位于細(xì)胞核之中。按照目前所有教科書的說法，在真核細(xì)胞的細(xì)胞核中，DNA一圈圈纏繞在組蛋白上，形成具有高級結(jié)構(gòu)的染色體。所以一直以來我們都有這樣的基本認(rèn)知：核DNA全部位于染色體中。

然而事實(shí)卻并非如此完美。

在特殊情況下（這里排除病毒感染等外源核酸的入侵），核DNA是有可能從染色體上脫離開來的。比如說，由于電離輻射、紫外線等因素，造成DNA雙鏈斷裂。通常情況下，我們的細(xì)胞會(huì)有相應(yīng)的修復(fù)機(jī)制，將缺失的DNA補(bǔ)回去，將廢掉的DNA排出細(xì)胞外。假設(shè)損傷過大，無法修復(fù)，細(xì)胞也會(huì)啟動(dòng)死亡機(jī)制，避免表達(dá)錯(cuò)誤的基因，也避免將錯(cuò)誤的遺傳信息傳遞給子代細(xì)胞。

不過，這個(gè)世界上卻有一類特立獨(dú)行的細(xì)胞。它們的遺傳信息出現(xiàn)了錯(cuò)誤，既不好好修復(fù)，又不想去死，讓我們十分為難。而這一類細(xì)胞便是我的研究對象——腫瘤細(xì)胞。

最近，我們實(shí)驗(yàn)室在Nature上發(fā)表了一篇有關(guān)腫瘤細(xì)胞染色體外DNA（extrachromosomal DNA，簡稱ecDNA）的文章：Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity。（傳送門 http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature21356.html）借此機(jī)會(huì)，本專欄將連續(xù)推出3篇文章，給各位讀者介紹腫瘤ecDNA的方方面面。

一、倍體異常和基因擴(kuò)增是惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的共性

早在1842年，瑞士植物學(xué)家Carl Wilhelm von N?geli率先觀察到染色體的存在，從而奠定了細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)。然而直到百余年后的1956年，科學(xué)家們才正式確定，人類體細(xì)胞具有46條染色體。不過在正式確定染色體數(shù)目之前，已經(jīng)有不少致力于觀察人類腫瘤染色體的研究，并得到一致的結(jié)論：惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，或者說腫瘤細(xì)胞，其染色體數(shù)量和正常細(xì)胞的是不一致的，通常是非整倍體地增多。如下圖是一篇很早期的文獻(xiàn)，報(bào)道了人腦膠質(zhì)瘤有81條染色體。

染色體數(shù)量的增加，意味著基因拷貝數(shù)的增加。如果刺激生長的基因數(shù)量增加了，那么這個(gè)細(xì)胞的增殖就容易失控，并在復(fù)雜的多基因相互作用及環(huán)境選擇的驅(qū)動(dòng)下，演化成腫瘤。比如說，許多上皮型腫瘤的7號染色體往往會(huì)增加，而這條染色體攜帶了驅(qū)動(dòng)這一類型腫瘤的EGFR基因（表皮生長因子受體）。

染色體數(shù)目增加，是否就是腫瘤細(xì)胞原癌基因拷貝數(shù)增加的唯一機(jī)制呢？其實(shí)不是。在腫瘤細(xì)胞混亂的核型之中，其實(shí)埋藏了許多基因擴(kuò)增的可能性。

二、染色體外DNA攜帶擴(kuò)增的原癌基因

在研究腫瘤核型的時(shí)候，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了很奇怪的現(xiàn)象。除了染色體數(shù)量非整倍增加之外，還可觀察到：1、染色體外還有許多能夠被染料著色的小點(diǎn)；2、帶型染色時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)部分染色體呈現(xiàn)大面積的明帶或暗帶。

如下圖A和B，我們可以發(fā)現(xiàn)染色體外還存在一些或大或小的染色信號。圖C則可以發(fā)現(xiàn)，染色體有異常長的明帶。

圖A和B的那些小點(diǎn)到底是什么？是染料中的雜質(zhì)嗎？是制備樣本時(shí)不小心把染色體打碎了嗎？答案是否定的，因?yàn)橛猛瑯拥姆椒ㄖ苽湔＜?xì)胞的樣本時(shí)，卻沒有發(fā)現(xiàn)這些小點(diǎn)的存在，說明這并不是技術(shù)錯(cuò)誤導(dǎo)致的。而圖C的大面積異常的帶型，也并非是制備樣品時(shí)把幾條染色體黏在一起了。在熒光顯微技術(shù)，以及熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）發(fā)展起來之后，我們終于明白，原來這里面蘊(yùn)藏著大量的原癌基因拷貝。

比如說上圖這個(gè)腫瘤細(xì)胞系，我們用DAPI（藍(lán)色）來染DNA，用紅色的FISH探針來染原癌基因EGFR，用綠色的FISH探針來標(biāo)記人類7號染色體。（注：EGFR基因位于7號染色體。以及這張圖出自我們實(shí)驗(yàn)室。）

可以發(fā)現(xiàn)，只用DAPI標(biāo)記DNA，同樣可以在左邊的樣本中觀察到許多游離于染色體外的小點(diǎn)，即ecDNA。通過FISH探針可以發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的ecDNA都包含了EGFR基因。右邊的樣本，EGFR基因的信號則“擠”在一起，形成強(qiáng)染色區(qū)域。這也是在做核型染色時(shí)會(huì)出現(xiàn)連續(xù)大面積的明帶或暗帶的原因。我們把這樣的染色區(qū)域稱為homogeneously staining regions（HSR，均勻染色區(qū)）。值得注意的一個(gè)現(xiàn)象是，HSR上的EGFR基因，絕大部分不在7號染色體上，而是插到別的染色體，或者自成一體了。

三、ecDNA普遍存在于腫瘤細(xì)胞中

我們不禁要問，ecDNA這種現(xiàn)象，是不是腫瘤細(xì)胞所特有的？又是否為腫瘤細(xì)胞的共性？如下圖所示（第三節(jié)的圖都出自那篇Nature文章，不逐一標(biāo)注來源了），我們統(tǒng)計(jì)了來自143個(gè)樣本、共計(jì)2572個(gè)me taphase有絲分裂中期核型（只有制備有絲分裂中期的核型才可檢測ecDNA），發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞的me taphase中極少出現(xiàn)ecDNA，永生化細(xì)胞的me taphase存在ecDNA的比例增高，惡性轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞me taphase的ecDNA比例更高。

（注：這種圖叫做beanplot，中文名姑且稱為豆莢圖。它是傳統(tǒng)box plot箱式圖的升級版，既展示了所有數(shù)據(jù)的分布范圍——可展示最大值和最小值，又在水平方向上展示數(shù)據(jù)的相對分布頻數(shù)——越“胖”則相對頻數(shù)越高。據(jù)我所知，目前可用R語言來生成beanplot。）

假如把受檢的me taphase按照癌種分類，我們可以看出，不同腫瘤細(xì)胞類型中ecDNA的比例和數(shù)量是不同的。比如結(jié)腸癌細(xì)胞系me taphase的ecDNA比例低、數(shù)量少，而腦腫瘤GBM的ecDNA比例高，數(shù)量多。

在每個(gè)樣本至少統(tǒng)計(jì)20個(gè)me taphase的情況下，如果將超過10%的me taphase出現(xiàn)不少于2個(gè)ecDNA的樣本，定義為ecDNA陽性樣本，并重新繪制一張如下的統(tǒng)計(jì)圖（藍(lán)色陰性，紅色陽性），我們可以看到，正常細(xì)胞極少陽性，而在傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞系（established cell line）中，有接近40%存在ecDNA。在PDX，也就是patient-derived xenograft原代異位移植瘤中，近90%的樣本是ecDNA陽性。

同樣地，按照癌種來劃分的話，不同類型的腫瘤，ecDNA陽性的比例也不同。如下圖所示：

此外，還有一個(gè)值得重視的現(xiàn)象：對于一個(gè)細(xì)胞群體來說，不同細(xì)胞攜帶ecDNA的數(shù)量是不同的。有的細(xì)胞，可能完全沒有ecDNA，而有的細(xì)胞，可以攜帶幾十甚至上百個(gè)ecDNA。通過直方圖我們可以看出，在細(xì)胞群體中，單細(xì)胞中ecDNA數(shù)量的分布可能呈正態(tài)分布，也可能呈偏鋒或雙峰分布。

結(jié)合新一代測序和FISH實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步證明，常見的擴(kuò)增原癌基因普遍位于ecDNA，包括僅存在于ecDNA和共同存在于HSR。至此我們可以得出結(jié)論，攜帶原癌基因的ecDNA廣泛存在于腫瘤中，并具有復(fù)雜的分布方式。而正常細(xì)胞幾乎不存在ecDNA。

四、為什么ecDNA直到近年才得到重視？

或許各位讀者并不清楚，早在1962年，科學(xué)家就獲得了第一張疑似腫瘤細(xì)胞存在ecDNA的照片，并于1965年正式在腫瘤細(xì)胞中確認(rèn)ecDNA的存在（當(dāng)時(shí)的叫法是微型染色質(zhì)小體minute chromatin bodies，這里minute的讀音是/mainju:t/，而不是/minit/）。

讀到這里，你是不是也很疑惑：為什么如此普遍的現(xiàn)象，卻一直沒有受到足夠的重視？按道理這種幾十年前的發(fā)現(xiàn)，早就應(yīng)該被寫進(jìn)教科書了，為何在我們本科甚至研究生的細(xì)胞、遺傳學(xué)等學(xué)科的課堂上，相關(guān)知識卻鮮被提起？而在腫瘤研究領(lǐng)域，盡管在上世紀(jì)60年代以后陸續(xù)有證據(jù)支持，這些ecDNA攜帶著原癌基因，但卻甚少有研究去探討為何ecDNA會(huì)在腫瘤演化中被選擇出來，對腫瘤有什么意義。是因?yàn)閑cDNA并不是什么重要的東西嗎？其實(shí)不是。我們對此的理解是，新技術(shù)的誕生，反而讓科學(xué)家忘記去思考一些最基本的問題。

提到研究原癌基因的拷貝數(shù)，不知各位首先會(huì)想到什么方法？

我想絕大多數(shù)人的第一反應(yīng)是：設(shè)計(jì)引物做一下qPCR，或者干脆直接上測序。FISH？這么老土又費(fèi)力的方法，才懶得去做，只有誕生在幾十年前沒有PCR更沒有測序時(shí)代的長者才會(huì)去用吧。

我承認(rèn)我以前也這么naive過。沒錯(cuò)，測序技術(shù)的發(fā)展，我們對基因組的研究精度是越來越高，分辨率早就到達(dá)單堿基水平了。但是，這種序列分辨率的提升，卻犧牲了空間分辨率——我們越來越搞不清楚，測出來的某一段序列，到底位于基因組的什么位置。

這時(shí)候可能有人跳出來嘗試打本司機(jī)的臉說，人類基因組早就不知道測完多少年了，現(xiàn)在拿到測序數(shù)據(jù)后，只要mapping回去就知道是染色體的什么位置了。但我們要明白的是，人類基因組計(jì)劃測的是健康人的基因組，默認(rèn)46條染色體不多不少?？墒窃谀[瘤中卻有ecDNA的存在，而測序在mapping的時(shí)候可不管那么多。因此我們經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在的測序數(shù)據(jù)得到的基因擴(kuò)增圖譜，就是一段染色體，上面畫一些高高低低的曲線，代表擴(kuò)增或者缺失的區(qū)域，但卻鮮有人去問，擴(kuò)增出來的序列，到底擴(kuò)增到哪里去了，或者干脆默認(rèn)多份串聯(lián)排列在同一條染色體上了。（如下圖所示，擴(kuò)增在ecDNA與擴(kuò)增在HSR的EGFRvIII基因，通過測序繪制出來的圖譜幾乎是一樣的，但通過老土的FISH方法卻能得知兩者的空間定位不同。所以說，要聽長者的話。）

第二個(gè)原因是，傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系（established cell line）在過去幾十年間成為了絕對主流的研究對象。然而我們的研究卻指出，這類經(jīng)多次傳代的established cell line，僅有40%是ecDNA陽性的，而在PDX模型中卻高達(dá)90%。這說明，研究對象的“先天”不足，也可能導(dǎo)致ecDNA受到忽視。近幾年，腫瘤領(lǐng)域支持使用PDX或原代球培養(yǎng)PDC（patient-derived cell）的呼聲越來越高，并指出established cell line的各種缺陷，我想，以后應(yīng)該會(huì)有越來越多的科學(xué)家加入ecDNA的研究隊(duì)伍之中。

還有一個(gè)可能的原因是技術(shù)的限制。研究ecDNA必須觀察有絲分裂中期me taphase的核型。而制備me taphase必須使用處于有絲分裂的細(xì)胞，因此無法直接在組織塊中研究，而須先進(jìn)行原代分離培養(yǎng)。而一旦使用傳統(tǒng)的建系方案而非近幾年推崇的無血清球培養(yǎng)方案，則變成了established cell line，有可能丟失ecDNA。此外，制備me taphase的步驟也比較繁瑣，并不是每個(gè)人都愿意去做。

小結(jié)

這一篇文章，本司機(jī)向大家介紹了蘊(yùn)藏著原癌基因的染色體外DNA。原來，腫瘤擴(kuò)增原癌基因，并不僅僅是通過擴(kuò)增染色體數(shù)目、或者串聯(lián)排列在同一條染色體上來實(shí)現(xiàn)的，而可以存在于ecDNA和HSR。有了ecDNA的機(jī)制，每個(gè)腫瘤細(xì)胞可以獲得高達(dá)上百個(gè)拷貝的原癌基因。

除了可以擁有更高的拷貝數(shù)之外，利用ecDNA來承載原癌基因還有什么優(yōu)勢呢？敬請期待下一篇文章的講解。

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（知乎欄目：老司機(jī)的生物學(xué)課堂）

文 | 吳思涵

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