文|吳思涵

前言

DNA存在于真核細胞的哪些位置呢？如果你學習過高中生物，應(yīng)該可以很輕松地回答：細胞核、線粒體、葉綠體。

絕大多數(shù)DNA位于細胞核之中。按照目前所有教科書的說法，在真核細胞的細胞核中，DNA一圈圈纏繞在組蛋白上，形成具有高級結(jié)構(gòu)的染色體。所以一直以來我們都有這樣的基本認知：核DNA全部位于染色體中。

然而事實卻并非如此完美。

在特殊情況下（這里排除病毒感染等外源核酸的入侵），核DNA是有可能從染色體上脫離開來的。比如說，由于電離輻射、紫外線等因素，造成DNA雙鏈斷裂。通常情況下，我們的細胞會有相應(yīng)的修復機制，將缺失的DNA補回去，將廢掉的DNA排出細胞外。假設(shè)損傷過大，無法修復，細胞也會啟動死亡機制，避免表達錯誤的基因，也避免將錯誤的遺傳信息傳遞給子代細胞。

不過，這個世界上卻有一類特立獨行的細胞。它們的遺傳信息出現(xiàn)了錯誤，既不好好修復，又不想去死，讓我們十分為難。而這一類細胞便是我的研究對象——腫瘤細胞。

最近，我們實驗室在Nature上發(fā)表了一篇有關(guān)腫瘤細胞染色體外DNA（extrachromosomal DNA，簡稱ecDNA）的文章：Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity。（傳送門 http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature21356.html）借此機會，本專欄將連續(xù)推出3篇文章，給各位讀者介紹腫瘤ecDNA的方方面面。

一、倍體異常和基因擴增是惡性轉(zhuǎn)化細胞的共性

早在1842年，瑞士植物學家Carl Wilhelm von N?geli率先觀察到染色體的存在，從而奠定了細胞遺傳學的基礎(chǔ)。然而直到百余年后的1956年，科學家們才正式確定，人類體細胞具有46條染色體。不過在正式確定染色體數(shù)目之前，已經(jīng)有不少致力于觀察人類腫瘤染色體的研究，并得到一致的結(jié)論：惡性轉(zhuǎn)化細胞，或者說腫瘤細胞，其染色體數(shù)量和正常細胞的是不一致的，通常是非整倍體地增多。如下圖是一篇很早期的文獻，報道了人腦膠質(zhì)瘤有81條染色體。

染色體數(shù)量的增加，意味著基因拷貝數(shù)的增加。如果刺激生長的基因數(shù)量增加了，那么這個細胞的增殖就容易失控，并在復雜的多基因相互作用及環(huán)境選擇的驅(qū)動下，演化成腫瘤。比如說，許多上皮型腫瘤的7號染色體往往會增加，而這條染色體攜帶了驅(qū)動這一類型腫瘤的EGFR基因（表皮生長因子受體）。

染色體數(shù)目增加，是否就是腫瘤細胞原癌基因拷貝數(shù)增加的唯一機制呢？其實不是。在腫瘤細胞混亂的核型之中，其實埋藏了許多基因擴增的可能性。

二、染色體外DNA攜帶擴增的原癌基因

在研究腫瘤核型的時候，科學家們發(fā)現(xiàn)了很奇怪的現(xiàn)象。除了染色體數(shù)量非整倍增加之外，還可觀察到：1、染色體外還有許多能夠被染料著色的小點；2、帶型染色時，會發(fā)現(xiàn)部分染色體呈現(xiàn)大面積的明帶或暗帶。

如下圖A和B，我們可以發(fā)現(xiàn)染色體外還存在一些或大或小的染色信號。圖C則可以發(fā)現(xiàn)，染色體有異常長的明帶。

圖A和B的那些小點到底是什么？是染料中的雜質(zhì)嗎？是制備樣本時不小心把染色體打碎了嗎？答案是否定的，因為用同樣的方法制備正常細胞的樣本時，卻沒有發(fā)現(xiàn)這些小點的存在，說明這并不是技術(shù)錯誤導致的。而圖C的大面積異常的帶型，也并非是制備樣品時把幾條染色體黏在一起了。在熒光顯微技術(shù)，以及熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）發(fā)展起來之后，我們終于明白，原來這里面蘊藏著大量的原癌基因拷貝。

比如說上圖這個腫瘤細胞系，我們用DAPI（藍色）來染DNA，用紅色的FISH探針來染原癌基因EGFR，用綠色的FISH探針來標記人類7號染色體。（注：EGFR基因位于7號染色體。以及這張圖出自我們實驗室。）

可以發(fā)現(xiàn)，只用DAPI標記DNA，同樣可以在左邊的樣本中觀察到許多游離于染色體外的小點，即ecDNA。通過FISH探針可以發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的ecDNA都包含了EGFR基因。右邊的樣本，EGFR基因的信號則“擠”在一起，形成強染色區(qū)域。這也是在做核型染色時會出現(xiàn)連續(xù)大面積的明帶或暗帶的原因。我們把這樣的染色區(qū)域稱為homogeneously staining regions（HSR，均勻染色區(qū)）。值得注意的一個現(xiàn)象是，HSR上的EGFR基因，絕大部分不在7號染色體上，而是插到別的染色體，或者自成一體了。

三、ecDNA普遍存在于腫瘤細胞中

我們不禁要問，ecDNA這種現(xiàn)象，是不是腫瘤細胞所特有的？又是否為腫瘤細胞的共性？如下圖所示（第三節(jié)的圖都出自那篇Nature文章，不逐一標注來源了），我們統(tǒng)計了來自143個樣本、共計2572個me taphase有絲分裂中期核型（只有制備有絲分裂中期的核型才可檢測ecDNA），發(fā)現(xiàn)正常細胞的me taphase中極少出現(xiàn)ecDNA，永生化細胞的me taphase存在ecDNA的比例增高，惡性轉(zhuǎn)化腫瘤細胞me taphase的ecDNA比例更高。

（注：這種圖叫做beanplot，中文名姑且稱為豆莢圖。它是傳統(tǒng)box plot箱式圖的升級版，既展示了所有數(shù)據(jù)的分布范圍——可展示最大值和最小值，又在水平方向上展示數(shù)據(jù)的相對分布頻數(shù)——越“胖”則相對頻數(shù)越高。據(jù)我所知，目前可用R語言來生成beanplot。）

假如把受檢的me taphase按照癌種分類，我們可以看出，不同腫瘤細胞類型中ecDNA的比例和數(shù)量是不同的。比如結(jié)腸癌細胞系me taphase的ecDNA比例低、數(shù)量少，而腦腫瘤GBM的ecDNA比例高，數(shù)量多。

在每個樣本至少統(tǒng)計20個me taphase的情況下，如果將超過10%的me taphase出現(xiàn)不少于2個ecDNA的樣本，定義為ecDNA陽性樣本，并重新繪制一張如下的統(tǒng)計圖（藍色陰性，紅色陽性），我們可以看到，正常細胞極少陽性，而在傳統(tǒng)的腫瘤細胞系（established cell line）中，有接近40%存在ecDNA。在PDX，也就是patient-derived xenograft原代異位移植瘤中，近90%的樣本是ecDNA陽性。

同樣地，按照癌種來劃分的話，不同類型的腫瘤，ecDNA陽性的比例也不同。如下圖所示：

此外，還有一個值得重視的現(xiàn)象：對于一個細胞群體來說，不同細胞攜帶ecDNA的數(shù)量是不同的。有的細胞，可能完全沒有ecDNA，而有的細胞，可以攜帶幾十甚至上百個ecDNA。通過直方圖我們可以看出，在細胞群體中，單細胞中ecDNA數(shù)量的分布可能呈正態(tài)分布，也可能呈偏鋒或雙峰分布。

結(jié)合新一代測序和FISH實驗，我們進一步證明，常見的擴增原癌基因普遍位于ecDNA，包括僅存在于ecDNA和共同存在于HSR。至此我們可以得出結(jié)論，攜帶原癌基因的ecDNA廣泛存在于腫瘤中，并具有復雜的分布方式。而正常細胞幾乎不存在ecDNA。

四、為什么ecDNA直到近年才得到重視？

或許各位讀者并不清楚，早在1962年，科學家就獲得了第一張疑似腫瘤細胞存在ecDNA的照片，并于1965年正式在腫瘤細胞中確認ecDNA的存在（當時的叫法是微型染色質(zhì)小體minute chromatin bodies，這里minute的讀音是/mainju:t/，而不是/minit/）。

讀到這里，你是不是也很疑惑：為什么如此普遍的現(xiàn)象，卻一直沒有受到足夠的重視？按道理這種幾十年前的發(fā)現(xiàn)，早就應(yīng)該被寫進教科書了，為何在我們本科甚至研究生的細胞、遺傳學等學科的課堂上，相關(guān)知識卻鮮被提起？而在腫瘤研究領(lǐng)域，盡管在上世紀60年代以后陸續(xù)有證據(jù)支持，這些ecDNA攜帶著原癌基因，但卻甚少有研究去探討為何ecDNA會在腫瘤演化中被選擇出來，對腫瘤有什么意義。是因為ecDNA并不是什么重要的東西嗎？其實不是。我們對此的理解是，新技術(shù)的誕生，反而讓科學家忘記去思考一些最基本的問題。

提到研究原癌基因的拷貝數(shù)，不知各位首先會想到什么方法？

我想絕大多數(shù)人的第一反應(yīng)是：設(shè)計引物做一下qPCR，或者干脆直接上測序。FISH？這么老土又費力的方法，才懶得去做，只有誕生在幾十年前沒有PCR更沒有測序時代的長者才會去用吧。

我承認我以前也這么naive過。沒錯，測序技術(shù)的發(fā)展，我們對基因組的研究精度是越來越高，分辨率早就到達單堿基水平了。但是，這種序列分辨率的提升，卻犧牲了空間分辨率——我們越來越搞不清楚，測出來的某一段序列，到底位于基因組的什么位置。

這時候可能有人跳出來嘗試打本司機的臉說，人類基因組早就不知道測完多少年了，現(xiàn)在拿到測序數(shù)據(jù)后，只要mapping回去就知道是染色體的什么位置了。但我們要明白的是，人類基因組計劃測的是健康人的基因組，默認46條染色體不多不少?？墒窃谀[瘤中卻有ecDNA的存在，而測序在mapping的時候可不管那么多。因此我們經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在的測序數(shù)據(jù)得到的基因擴增圖譜，就是一段染色體，上面畫一些高高低低的曲線，代表擴增或者缺失的區(qū)域，但卻鮮有人去問，擴增出來的序列，到底擴增到哪里去了，或者干脆默認多份串聯(lián)排列在同一條染色體上了。（如下圖所示，擴增在ecDNA與擴增在HSR的EGFRvIII基因，通過測序繪制出來的圖譜幾乎是一樣的，但通過老土的FISH方法卻能得知兩者的空間定位不同。所以說，要聽長者的話。）

第二個原因是，傳統(tǒng)腫瘤細胞系（established cell line）在過去幾十年間成為了絕對主流的研究對象。然而我們的研究卻指出，這類經(jīng)多次傳代的established cell line，僅有40%是ecDNA陽性的，而在PDX模型中卻高達90%。這說明，研究對象的“先天”不足，也可能導致ecDNA受到忽視。近幾年，腫瘤領(lǐng)域支持使用PDX或原代球培養(yǎng)PDC（patient-derived cell）的呼聲越來越高，并指出established cell line的各種缺陷，我想，以后應(yīng)該會有越來越多的科學家加入ecDNA的研究隊伍之中。

還有一個可能的原因是技術(shù)的限制。研究ecDNA必須觀察有絲分裂中期me taphase的核型。而制備me taphase必須使用處于有絲分裂的細胞，因此無法直接在組織塊中研究，而須先進行原代分離培養(yǎng)。而一旦使用傳統(tǒng)的建系方案而非近幾年推崇的無血清球培養(yǎng)方案，則變成了established cell line，有可能丟失ecDNA。此外，制備me taphase的步驟也比較繁瑣，并不是每個人都愿意去做。

小結(jié)

這一篇文章，本司機向大家介紹了蘊藏著原癌基因的染色體外DNA。原來，腫瘤擴增原癌基因，并不僅僅是通過擴增染色體數(shù)目、或者串聯(lián)排列在同一條染色體上來實現(xiàn)的，而可以存在于ecDNA和HSR。有了ecDNA的機制，每個腫瘤細胞可以獲得高達上百個拷貝的原癌基因。

除了可以擁有更高的拷貝數(shù)之外，利用ecDNA來承載原癌基因還有什么優(yōu)勢呢？敬請期待下一篇文章的講解。

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（知乎欄目：老司機的生物學課堂）

文 | 吳思涵

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