文|吳思涵

前篇回顧

前面的兩篇有關(guān)ecDNA的文章，向大家介紹了攜帶著擴增原癌基因拷貝的染色體外DNA。這些小片段的ecDNA由于缺乏著絲粒，因此在細胞有絲分裂時，是隨機分配到兩個子代細胞中的。這樣的特性，使得部分腫瘤細胞可以迅速獲得大量原癌基因拷貝，并在腫瘤內(nèi)部產(chǎn)生了高度異質(zhì)性，從而驅(qū)動了腫瘤的演化與適應(yīng)。這一篇文章主要向大家介紹，ecDNA會對腫瘤的治療帶來何種挑戰(zhàn)。

一、抗腫瘤藥物上調(diào)原癌ecDNA拷貝數(shù)的例子

提起腫瘤耐藥，排除藥代動力學(xué)的因素，最常見的機制便是腫瘤產(chǎn)生了新的突變，或激活了代償生存通路，使得腫瘤細胞可以在藥物的攻擊下存活。但讓人驚訝的是，腫瘤細胞竟然還可以通過改變基因拷貝數(shù)從而產(chǎn)生抗藥性。這里先來為大家介紹一個經(jīng)典的著名例子：化療藥甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）導(dǎo)致耐藥腫瘤細胞的二氫葉酸還原酶（Dihydrofolate reductase，DHFR）基因拷貝數(shù)升高。

MTX是一類抗腫瘤葉酸代謝藥，通過與DHFR酶的底物二氫葉酸（DHF）競爭性結(jié)合，阻斷了DNA的合成代謝，從而抑制腫瘤的生長。（如下圖所示）

早在上世紀(jì)四五十年代，MTX就已投入臨床使用。然而這個藥物卻不是萬能的，部分患者會在用藥一段時間后產(chǎn)生抗性。而由于MTX的毒性較強（葉酸代謝對正常細胞也很重要），因此不能輕易加高劑量。

MTX抗性機制有幾大類，一是藥物進入細胞的量變少了（藥物轉(zhuǎn)運蛋白表達量降低），二是藥物和DHFR的親和力降低（如DHFR基因產(chǎn)生突變），三是DHFR整體拷貝數(shù)增加了。這里我們來談?wù)劦谌齻€機制。

許多獨立研究表明，在MTX耐受的腫瘤樣本中，可以發(fā)現(xiàn)DHFR基因的拷貝數(shù)大量增加，甚至可高達幾十個拷貝。這些增加的拷貝數(shù)，不光可以出現(xiàn)在染色體上，還能以ecDNA的形式存在。如下圖的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)，用MTX處理結(jié)腸癌細胞HT29，可以使其DHFR基因拷貝數(shù)增加。通過熒光原位雜交（FISH）實驗發(fā)現(xiàn)，這些擴增的DHFR位于ecDNA。而對照組并沒有發(fā)現(xiàn)這樣的現(xiàn)象。

同樣的現(xiàn)象，通過檢索文獻還能發(fā)現(xiàn)許多，這里就不羅列了。而這樣的實驗結(jié)果證明，抗腫瘤藥可以上調(diào)原癌基因ecDNA的拷貝。本例中，大量表達的DHFR基因克服了MTX對葉酸代謝的抑制作用，維持 DNA合成代謝活性，從而使腫瘤產(chǎn)生耐藥性。

二、抗腫瘤藥物下調(diào)原癌ecDNA數(shù)量的例子

前面的例子提到，腫瘤通過上調(diào)ecDNA數(shù)量而獲得藥物抗性，那有沒有可能通過下調(diào)的機制來獲得抗性呢？答案是有的。

2014年，我們實驗室在Science上發(fā)表了一篇文章，報道了靶向藥物厄洛替尼（Erlotinib，靶向EGFR蛋白激酶結(jié)構(gòu)域）可以導(dǎo)致腫瘤細胞丟失藥物靶點EGFR的ecDNA，產(chǎn)生抗性，并在藥物撤除后重新出現(xiàn)EGFR的ecDNA。

首先，我們證明了腦膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是一個異質(zhì)的群體，同時含有高表達和低表達原癌基因突變體EGFRvIII的細胞。在EGFRvIII high的細胞群體里，其PI3K/mTOR信號較強（上圖A），增殖快（B），具有較低的本底細胞死亡率（C），能攝取更多的葡萄糖（D和E）。而這群由EGFRvIII驅(qū)動的功能較為亢進的細胞群體，在面對靶向藥物Erlotinib的時候，也是死得最快的（F）。不過在用Erlotinib治療荷瘤鼠一段時間后，部分個體會出現(xiàn)藥物抗性（G）。通過進一步研究證明，無論是在有反應(yīng)（Response）還是產(chǎn)生抗性（Resistant）的樣本，Erlotinib確實都抑制了EGFRvIII high的細胞群體比例（上圖H）。那這個抗性是從何而來的呢？

我們把GBM注射到裸鼠皮下，讓它生長成一個攜帶EGFRvIII high和low的腫瘤。隨后，將腫瘤解剖出來，通過流式分選的方法，將高、低表達的群體區(qū)分開來，再立刻分別重新注射到不同的裸鼠上。雖然前面的實驗結(jié)果表明，EGFRvIII high的群體具有較亢進的惡性功能，但無論是low還是high的群體，在注射同樣細胞數(shù)量的情況下，都能讓裸鼠長出同等大小的腫瘤（上圖A）。而這些腫瘤里面，又重新分化出具有high和low的異質(zhì)群體（C）。同時令人驚訝的是，就算是一開始分離出high和low的群體，在體外培養(yǎng)一段時間后，high的平均表達量會逐漸降低，low的表達量會逐漸升高（B），最終這兩者又會變成同樣的混雜表達群體。這到底是基因表達強度的問題，還是有其他的原因？

通過進一步實驗，我們發(fā)現(xiàn)，原來是這些擴增的EGFRvIII位于ecDNA。通過有絲分裂時的隨機分配，EGFRvIII基因的拷貝數(shù)可實現(xiàn)動態(tài)調(diào)節(jié)。在普通狀態(tài)下，由于EGFRvIII高表達有利于腫瘤的生長，因此high的群體占據(jù)了優(yōu)勢。而在藥物Erlotinib的攻擊下，high的群體較為敏感，細胞死亡。然而在抗性群體中，絕大多數(shù)細胞都是低表達EGFRvIII的。通過FISH實驗和qPCR實驗（后一數(shù)據(jù)未在此展示）發(fā)現(xiàn)，這群Erlotinib抗性（ER）細胞，EGFRvIII基因的拷貝數(shù)特別低，并形成一種類似于均質(zhì)染色區(qū)（HSR）的結(jié)構(gòu)。而當(dāng)藥物撤除之后，EGFRvIII的ecDNA又重新出現(xiàn)，并且high群體又重新占據(jù)了主導(dǎo)。

這種動態(tài)調(diào)節(jié)ecDNA拷貝數(shù)，形成了一種類似“躲貓貓”的機制，讓腫瘤逃避了藥物的攻擊，并在藥物撤除后卷土重來。

三、尚待解決的問題：ecDNA數(shù)量動態(tài)調(diào)控的機制

那么現(xiàn)在問題來了，腫瘤細胞到底是通過什么方法來實現(xiàn)這種ecDNA數(shù)量的動態(tài)調(diào)控呢？遺憾的是，迄今為止，尚未有任何研究針對這個問題提供了明確的答案。

但這并不妨礙我們在此提出兩種假說：1、被動選擇機制；2、主動調(diào)節(jié)機制。

假如將每個腫瘤細胞視為獨立的個體，而這些基因表達量不同的個體組成了一個異質(zhì)的群體。接著，我們將藥物處理視為一種環(huán)境選擇壓力。在第一例中，高表達DHFR基因的群體在藥物MTX的壓力下，具有更強的存活能力，因此得以保留與遺傳（即產(chǎn)生子代細胞），而低表達的則被淘汰掉（死亡）。在例二中，低表達EGFRvIII的細胞則在藥物Erlotinib的壓力下更有存活優(yōu)勢。經(jīng)過長期的藥物選擇，劣勢群體逐漸消失，而優(yōu)勢群體被富集起來。因此最后我們能發(fā)現(xiàn)，腫瘤整體的DNA拷貝數(shù)發(fā)生了變化，產(chǎn)生了耐藥性。此為被動選擇機制。

而主動調(diào)節(jié)機制則是，腫瘤細胞通過某種未知的途徑，“感應(yīng)”環(huán)境的壓力，繼而產(chǎn)生更多或者減少攜帶原癌基因ecDNA的數(shù)量，從而產(chǎn)生抗性。

然而無論是哪一種機制，也僅有ecDNA的存在，才能讓腫瘤快速改變基因拷貝數(shù)，從而獲得強大的適應(yīng)性。回顧《中篇》的內(nèi)容，我們不難理解，假設(shè)擴增的原癌基因全部位于染色體上，要實現(xiàn)拷貝數(shù)的快速變化，實在太難了。

最后，本司機要聲明的是：1、以上兩個機制僅是假說，尚未有發(fā)表的實驗數(shù)據(jù)的支持，所以不要太當(dāng)真。2、這兩個假說機制可以只存在一種，也可能同時存在。3、我們實驗室正在進行相關(guān)研究，但在文章正式發(fā)表之前需要保密，因此具體細節(jié)無可奉告。

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（知乎欄目：老司機的生物學(xué)課堂）

文 | 吳思涵

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