文|吳思涵

前篇回顧

前面的兩篇有關(guān)ecDNA的文章，向大家介紹了攜帶著擴(kuò)增原癌基因拷貝的染色體外DNA。這些小片段的ecDNA由于缺乏著絲粒，因此在細(xì)胞有絲分裂時(shí)，是隨機(jī)分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中的。這樣的特性，使得部分腫瘤細(xì)胞可以迅速獲得大量原癌基因拷貝，并在腫瘤內(nèi)部產(chǎn)生了高度異質(zhì)性，從而驅(qū)動(dòng)了腫瘤的演化與適應(yīng)。這一篇文章主要向大家介紹，ecDNA會(huì)對(duì)腫瘤的治療帶來(lái)何種挑戰(zhàn)。

一、抗腫瘤藥物上調(diào)原癌ecDNA拷貝數(shù)的例子

提起腫瘤耐藥，排除藥代動(dòng)力學(xué)的因素，最常見(jiàn)的機(jī)制便是腫瘤產(chǎn)生了新的突變，或激活了代償生存通路，使得腫瘤細(xì)胞可以在藥物的攻擊下存活。但讓人驚訝的是，腫瘤細(xì)胞竟然還可以通過(guò)改變基因拷貝數(shù)從而產(chǎn)生抗藥性。這里先來(lái)為大家介紹一個(gè)經(jīng)典的著名例子：化療藥甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）導(dǎo)致耐藥腫瘤細(xì)胞的二氫葉酸還原酶（Dihydrofolate reductase，DHFR）基因拷貝數(shù)升高。

MTX是一類抗腫瘤葉酸代謝藥，通過(guò)與DHFR酶的底物二氫葉酸（DHF）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻斷了DNA的合成代謝，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。（如下圖所示）

早在上世紀(jì)四五十年代，MTX就已投入臨床使用。然而這個(gè)藥物卻不是萬(wàn)能的，部分患者會(huì)在用藥一段時(shí)間后產(chǎn)生抗性。而由于MTX的毒性較強(qiáng)（葉酸代謝對(duì)正常細(xì)胞也很重要），因此不能輕易加高劑量。

MTX抗性機(jī)制有幾大類，一是藥物進(jìn)入細(xì)胞的量變少了（藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量降低），二是藥物和DHFR的親和力降低（如DHFR基因產(chǎn)生突變），三是DHFR整體拷貝數(shù)增加了。這里我們來(lái)談?wù)劦谌齻€(gè)機(jī)制。

許多獨(dú)立研究表明，在MTX耐受的腫瘤樣本中，可以發(fā)現(xiàn)DHFR基因的拷貝數(shù)大量增加，甚至可高達(dá)幾十個(gè)拷貝。這些增加的拷貝數(shù)，不光可以出現(xiàn)在染色體上，還能以ecDNA的形式存在。如下圖的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)，用MTX處理結(jié)腸癌細(xì)胞HT29，可以使其DHFR基因拷貝數(shù)增加。通過(guò)熒光原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些擴(kuò)增的DHFR位于ecDNA。而對(duì)照組并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這樣的現(xiàn)象。

同樣的現(xiàn)象，通過(guò)檢索文獻(xiàn)還能發(fā)現(xiàn)許多，這里就不羅列了。而這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，抗腫瘤藥可以上調(diào)原癌基因ecDNA的拷貝。本例中，大量表達(dá)的DHFR基因克服了MTX對(duì)葉酸代謝的抑制作用，維持 DNA合成代謝活性，從而使腫瘤產(chǎn)生耐藥性。

二、抗腫瘤藥物下調(diào)原癌ecDNA數(shù)量的例子

前面的例子提到，腫瘤通過(guò)上調(diào)ecDNA數(shù)量而獲得藥物抗性，那有沒(méi)有可能通過(guò)下調(diào)的機(jī)制來(lái)獲得抗性呢？答案是有的。

2014年，我們實(shí)驗(yàn)室在Science上發(fā)表了一篇文章，報(bào)道了靶向藥物厄洛替尼（Erlotinib，靶向EGFR蛋白激酶結(jié)構(gòu)域）可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞丟失藥物靶點(diǎn)EGFR的ecDNA，產(chǎn)生抗性，并在藥物撤除后重新出現(xiàn)EGFR的ecDNA。

首先，我們證明了腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是一個(gè)異質(zhì)的群體，同時(shí)含有高表達(dá)和低表達(dá)原癌基因突變體EGFRvIII的細(xì)胞。在EGFRvIII high的細(xì)胞群體里，其PI3K/mTOR信號(hào)較強(qiáng)（上圖A），增殖快（B），具有較低的本底細(xì)胞死亡率（C），能攝取更多的葡萄糖（D和E）。而這群由EGFRvIII驅(qū)動(dòng)的功能較為亢進(jìn)的細(xì)胞群體，在面對(duì)靶向藥物Erlotinib的時(shí)候，也是死得最快的（F）。不過(guò)在用Erlotinib治療荷瘤鼠一段時(shí)間后，部分個(gè)體會(huì)出現(xiàn)藥物抗性（G）。通過(guò)進(jìn)一步研究證明，無(wú)論是在有反應(yīng)（Response）還是產(chǎn)生抗性（Resistant）的樣本，Erlotinib確實(shí)都抑制了EGFRvIII high的細(xì)胞群體比例（上圖H）。那這個(gè)抗性是從何而來(lái)的呢？

我們把GBM注射到裸鼠皮下，讓它生長(zhǎng)成一個(gè)攜帶EGFRvIII high和low的腫瘤。隨后，將腫瘤解剖出來(lái)，通過(guò)流式分選的方法，將高、低表達(dá)的群體區(qū)分開(kāi)來(lái)，再立刻分別重新注射到不同的裸鼠上。雖然前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGFRvIII high的群體具有較亢進(jìn)的惡性功能，但無(wú)論是low還是high的群體，在注射同樣細(xì)胞數(shù)量的情況下，都能讓裸鼠長(zhǎng)出同等大小的腫瘤（上圖A）。而這些腫瘤里面，又重新分化出具有high和low的異質(zhì)群體（C）。同時(shí)令人驚訝的是，就算是一開(kāi)始分離出high和low的群體，在體外培養(yǎng)一段時(shí)間后，high的平均表達(dá)量會(huì)逐漸降低，low的表達(dá)量會(huì)逐漸升高（B），最終這兩者又會(huì)變成同樣的混雜表達(dá)群體。這到底是基因表達(dá)強(qiáng)度的問(wèn)題，還是有其他的原因？

通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，原來(lái)是這些擴(kuò)增的EGFRvIII位于ecDNA。通過(guò)有絲分裂時(shí)的隨機(jī)分配，EGFRvIII基因的拷貝數(shù)可實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。在普通狀態(tài)下，由于EGFRvIII高表達(dá)有利于腫瘤的生長(zhǎng)，因此high的群體占據(jù)了優(yōu)勢(shì)。而在藥物Erlotinib的攻擊下，high的群體較為敏感，細(xì)胞死亡。然而在抗性群體中，絕大多數(shù)細(xì)胞都是低表達(dá)EGFRvIII的。通過(guò)FISH實(shí)驗(yàn)和qPCR實(shí)驗(yàn)（后一數(shù)據(jù)未在此展示）發(fā)現(xiàn)，這群Erlotinib抗性（ER）細(xì)胞，EGFRvIII基因的拷貝數(shù)特別低，并形成一種類似于均質(zhì)染色區(qū)（HSR）的結(jié)構(gòu)。而當(dāng)藥物撤除之后，EGFRvIII的ecDNA又重新出現(xiàn)，并且high群體又重新占據(jù)了主導(dǎo)。

這種動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)ecDNA拷貝數(shù)，形成了一種類似“躲貓貓”的機(jī)制，讓腫瘤逃避了藥物的攻擊，并在藥物撤除后卷土重來(lái)。

三、尚待解決的問(wèn)題：ecDNA數(shù)量動(dòng)態(tài)調(diào)控的機(jī)制

那么現(xiàn)在問(wèn)題來(lái)了，腫瘤細(xì)胞到底是通過(guò)什么方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這種ecDNA數(shù)量的動(dòng)態(tài)調(diào)控呢？遺憾的是，迄今為止，尚未有任何研究針對(duì)這個(gè)問(wèn)題提供了明確的答案。

但這并不妨礙我們?cè)诖颂岢鰞煞N假說(shuō)：1、被動(dòng)選擇機(jī)制；2、主動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制。

假如將每個(gè)腫瘤細(xì)胞視為獨(dú)立的個(gè)體，而這些基因表達(dá)量不同的個(gè)體組成了一個(gè)異質(zhì)的群體。接著，我們將藥物處理視為一種環(huán)境選擇壓力。在第一例中，高表達(dá)DHFR基因的群體在藥物MTX的壓力下，具有更強(qiáng)的存活能力，因此得以保留與遺傳（即產(chǎn)生子代細(xì)胞），而低表達(dá)的則被淘汰掉（死亡）。在例二中，低表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞則在藥物Erlotinib的壓力下更有存活優(yōu)勢(shì)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的藥物選擇，劣勢(shì)群體逐漸消失，而優(yōu)勢(shì)群體被富集起來(lái)。因此最后我們能發(fā)現(xiàn)，腫瘤整體的DNA拷貝數(shù)發(fā)生了變化，產(chǎn)生了耐藥性。此為被動(dòng)選擇機(jī)制。

而主動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制則是，腫瘤細(xì)胞通過(guò)某種未知的途徑，“感應(yīng)”環(huán)境的壓力，繼而產(chǎn)生更多或者減少攜帶原癌基因ecDNA的數(shù)量，從而產(chǎn)生抗性。

然而無(wú)論是哪一種機(jī)制，也僅有ecDNA的存在，才能讓腫瘤快速改變基因拷貝數(shù)，從而獲得強(qiáng)大的適應(yīng)性。回顧《中篇》的內(nèi)容，我們不難理解，假設(shè)擴(kuò)增的原癌基因全部位于染色體上，要實(shí)現(xiàn)拷貝數(shù)的快速變化，實(shí)在太難了。

最后，本司機(jī)要聲明的是：1、以上兩個(gè)機(jī)制僅是假說(shuō)，尚未有發(fā)表的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，所以不要太當(dāng)真。2、這兩個(gè)假說(shuō)機(jī)制可以只存在一種，也可能同時(shí)存在。3、我們實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行相關(guān)研究，但在文章正式發(fā)表之前需要保密，因此具體細(xì)節(jié)無(wú)可奉告。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/25722401?group_id=824515041477943296

（知乎欄目：老司機(jī)的生物學(xué)課堂）

文 | 吳思涵

本文為作者授權(quán)肽度時(shí)界首發(fā)

僅為作者觀點(diǎn)，不代表肽度時(shí)界立場(chǎng)

本文未經(jīng)允許，不得轉(zhuǎn)載